E3泛素连接酶TRIM21经泛素-蛋白酶体系统调控染色质重塑因子BAF155

作     者：付瑜瑜 

作者单位：赣南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：谢元斌

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：核小体重塑 染色质重塑复合物SWI/SNF E3泛素连接酶 TRIM21 BAF155 

摘      要：背景:BAF(Brg/Brm-associated factors)复合体是一种依赖于ATPase的多亚基染色质重构体,可通过招募表观遗传因子重塑染色质,从而调控特定位点的基因组表达。研究表明,BAF复合体在维持正常的生物体功能中发挥重要作用,尤其是神经发育过程,包括神经干细胞的自我更新和增殖,树突发育和神经回路形成等。BAF复合物的核心亚基BAF155和BAF170维持着该复合物的完整性,当BAF155和BAF170被敲除后,所有其他已知的BAF亚基从复合体中解离,并通过蛋白酶体途径降解,从而影响神经细胞的染色质调控和基因表达。但是,目前对于BAF复合体中的核心亚基BAF155的调控机制尚不明确。课题组前期研究表明,E3泛素连接酶TRIM21可能与BAF155存在潜在的物理相互作用,但是,这种相互作用及其生物学意义也有待于进一步的挖掘。我们假设TRIM21通过物理相互作用并调节BAF155蛋白质降解,从而影响BAF155的生物学功能。因此了解TRIM21如何调节染色质重塑因子BAF155蛋白质水平及功能的研究,有助于揭示BAF155的稳态调控机制,对于理解TRIM21突变或/和BAF155突变所涉及的神经系统相关疾病至关重要。目的:通过探究E3泛素连接酶三基序蛋白21(tripartite motif-containing protein 21,TRIM21)与染色质重塑因子BAF155的相互作用,明确TRIM21在调控BAF155稳态的具体分子机制。方法:1.构建实验所需质粒,本研究中使用的质粒:p CAGGSBS-BAF155、pCMV-mycnuc-BAF155、TRIM21、HA-TRIM21、HA-TRIM21-△RING、HA-TRIM21-△B-BOX、HA-TRIM21-△SPRY、HA-TRIM21-△PRY、Control-shRNA、TRIM21-shRNA#1、TRIM21-shRNA#2、TRIM21-shRNA#3质粒均赠自Tran Tuoc博士,pcDNA-3xHA-Ub质粒赠自李玉梅博士,pcDNA3.1-3xHA-Ub-K48R和pcDNA3.1-3xHA-Ub-K63R通过PCR法突变生成。pCMV-myc-nuc-BAF155(1-956 aa)、(1-752 aa)、(1-608 aa)、(1-377aa)、(402-1105 aa)、(596-1105 aa)、(595-956 aa)等质粒通过扩增BAF155基因的不同片段(来自pCMV-myc-nuc-BAF155的扩增产物),插入由SalⅠ和NotⅠ酶切的pCMV-mycnuc载体构成。pcDNA3.1-HA-TRIM21-LD(C16A、C31A和H33W)表达质粒通过PCR诱导的突变法构建,将TRIM21-LD cDNA片段插入由EcoRI和XhoI酶切的pcDNA3.1-HA空载体(赠自Hueng-Sik Choi教授)构成。2.通过免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测TRIM21与BAF155的物理相互作用。在人胚肾细胞(HEK293T)中共转染过表达的HA-TRIM21与MycBAF155蛋白的真核表达质粒,通过Myc抗体免疫沉淀Myc-BAF155蛋白,检测共沉淀复合物中是否有HA-TRIM21的存在,从而确定细胞外源性的HA-TRIM21与MycBAF155是否存在相互作用;同样在HEK293T中提取全细胞裂解物,通过BAF155的抗体免疫沉淀BAF155,再通过蛋白质印迹技术检测TRIM21蛋白是否被共沉淀,从而确定细胞内源性的TRIM21与BAF155是否存在相互作用。3.通过蛋白质印迹技术(Western Blot,WB),在人胚肾细胞(HEK293T)和小鼠脑神经瘤细胞(Neuro-2A),检测过表达或敲低TRIM21对BAF155蛋白的影响。分别在HEK293T和Neuro-2A细胞中过表达或者敲低TRIM21基因,通过蛋白酶体抑制剂MG132处理后,经Western Blot检测BAF155在不同处理条件下的蛋白水平变化,以此探究TRIM21参与BAF155稳态调控的具体分子机制。结果:1.TRIM21与BAF155存在相互作用当HEK293T过表达Myc-BAF155和HA-TRIM21时,Myc抗体将Myc-BAF155与HA-TRIM21免疫共沉淀,表明细胞外源性BAF155与TRIM21相互作用。同时提取HEK293T全细胞裂解物,用特异性BAF155抗体免疫沉淀BAF155,在共沉淀复合物中检测到TRIM21蛋白,说明细胞内源性BAF155与TRIM21相互作用。2.过表达/敲低TRIM21可降低/升高BAF155的蛋白表达水平。在Neuro-2A细胞中,对照组共转染Myc-BAF155表达载体与pcDNA3.1(空载体),而实验组共转染Myc-BAF155表达载体与HA-TRIM21表达载体,我们发现与对照组相比,实验组的Myc-BAF155的蛋白表达被过表达的HA-TRIM21下调。相反地,在Neuro-2A细胞中,共转染Control-shRNA或TRIM21-shRNA表达载体,当TRIM21被TRIM21-shRNA敲低时,Myc-BAF155的蛋白表达水平升高,提示TRIM21负调控BAF155的蛋白表达水平。3.TRIM21介导BAF155的降解依赖于其E3泛素连接酶活性。在HEK293T细胞中共转染Myc-BAF155与pcDNA3.1/TRIM21-WT/TRIM21-LD表达载体,与过表达TRIM21-WT相比,TRIM21-LD突变体介导BAF155降解的能力显著减低,提示TRIM21对BAF155蛋白表达的负性调控依赖其E3泛素连接酶活性。4.过表达Ubiquitin增加BAF155的泛素化水平,而TRIM21明显促进BAF155的泛素化修饰。我们在HEK293T细胞中共转染HA-Ub与Myc-BAF155质粒,经MG132处理0h、12 h、24 h后,通过Myc抗体免疫共沉淀,再用Ubiquitin抗体检测BAF155的泛素化水平。随着过表达Ubiquitin促进了Myc-BAF155泛素化,而共孵育MG132使这种泛素化检测更为明显。与此同时,过表达TRIM21也明显促进BAF155的泛素化。5.过表达TRIM21使得BAF155因泛素化修饰而降解增加,而MG132处理可部分恢复BAF155蛋白水平。共转染Myc-BAF155与HA-TRIM21后的WB结果显示,过表达TRIM21可降低Myc-BAF155的蛋白水平,而共孵育MG132 12 h或24 h可部分恢复Myc-BAF155蛋白的表达水平。6.Ub-K63参与了TRIM21介导的BAF155泛素化修饰。将Myc-BAF155、HA-Ub WT/HA-Ub K48R/HA-Ub K63R与HA-TRIM21表达质粒共转染于HEK293T细胞中,通过Myc抗体共沉淀检测表明,与HA-Ub WT相比,HAUb K63突变体的泛素化水平降低。7.TRIM21中的RING与SPRY结构域参与BAF155的降解;BAF155基因中的K354可能是TRIM21介导降解的主要泛素化位点。将Myc-BAF155的各截短突变体与HA-TRIM21的真核表达质粒共转染于HEK293T细胞中,首先通过蛋白印迹结果明确BAF155(1-608 aa)是可被TRIM21降解的最小结构域,其次构建Myc-BAF155(1-608 aa)中的赖氨酸突变体的真核表达载体,并将各突变体载体与HA-TRIM21共转染于HEK293T细胞,BAF155中的K354残基可能为TRIM21介导降解的主要泛素化位点。在平行实验中,将HA-TRIM21的各截短突变体与Myc-BAF155共转染于HEK293T细胞中,蛋白质印迹结果显示当HATRIM21中的RING和SPRY结构域缺失时,Myc-BAF155几乎不被降解。结论:我们通过一系列的生化实验证明了TRIM21可作用于染色质重塑BAF复合物中的关键亚基BAF155,并且通过泛素介导的蛋白酶体途径调控BAF155的蛋白稳定性。