基于lncRNA CRNDE调控肝细胞增殖与凋亡探讨解毒化瘀颗粒拮抗肝衰竭机制研究

作     者：邓霖霖 

作者单位：广西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：石清兰

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：肝衰竭 解毒化瘀颗粒 CRNDE PI3K/Akt/mTOR信号通路 增殖凋亡 

摘      要：目的:1.观察lncRNA CRNDE在肝衰竭患者的表达及解毒化瘀颗粒对其表达的影响。2.观察lncRNACRNDE及PI3K/Akt/mTOR信号通路在ALF大鼠中的表达规律及解毒化瘀颗粒调控该通路的效应机制。方法:1.临床研究:将纳入的48例肝衰竭住院患者,其中慢加急性肝衰竭患者38例,亚急性肝衰竭患者3例,急性肝衰竭患者2例,慢性肝衰竭患者5例,随机分为西医对照组与解毒化瘀颗粒组(简称JDHY组),每组各24例,同时纳入10例健康受试者,命名为正常组。西医对照组予西医内科综合治疗,JDHY组在西医内科综合治疗基础上加予解毒化瘀颗粒,疗程为4周。正常组除对其行血清CRNDE含量检测外,不予以其他任何干预。(1)正常组、西医对照组、JDHY组入院时分别采血1次,收集血清行qRT-PCR检测以分析CRNDE含量表达;并检测分析西医对照组、JDHY组治疗4周后血清CRNDE含量表达。(2)西医对照组、JDHY组患者在入院时、治疗4周后分别各予检测肝功能及凝血功能,计算中医证候评分及评价临床疗效。2.实验研究:选取SD大鼠34只,雄性,体重250±30g,适应性饲养一周后,分为3组,正常组10只、模型组12只及解毒化瘀颗粒(JDHY)组 12 只,模型组、JDHY 组予 D-GalN(600mg/kg)+LPS(10μg/kg)腹腔注射一次成模,JDHY组腹腔注射前7天予灌胃,灌胃量2mL/100g,每天分早晚2次灌(间隔12h),一直灌至造模后24h,正常组、模型组每天予同等量的生理盐水灌胃。大鼠造模成功24h,采集腹主动脉血及肝组织,HE染色观察肝组织病理,qRT-PCR检测肝组织CRNDE含量表达,Western blot检测肝组织PI3K、Akt及CyclinD1蛋白表达水平,ELISA检测肝组织mTOR蛋白表达水平,自动化分析仪检测TBiL、ALT及AST指标,TUNEL染色观察肝细胞凋亡情况。结果:1.临床研究:(1)与正常组相比,治疗前西医对照组与JDHY组患者血清CRNDE含量表达均下降(P0.05)。(2)与治疗前相比,治疗后西医对照组与JDHY组血清CRNDE含量表达均上升,且JDHY组上升更为明显(P0.05),差异有统计学意义。(3)与治疗前相比,治疗后西医对照组、JDHY组TBiL、ALT、AST、PT均下降,ALB、PTA较前上升,中医证候评分下降(P0.05),差异有统计学意义;与西医对照组相比,JDHY组TBiL、ALT、AST、PT均下降,ALB、PTA上升,中医证候评分下降(P0.05),差异有统计学意义。2.实验研究:(1)HE染色:正常组大鼠肝组织肝小叶结构完整,肝索排列规律整齐,条理分布清晰,肝细胞围绕中央静脉呈放射状分布,肝细胞未见肿胀、变性及坏死,肝窦结构完整,肝窦内皮细胞规整,排列有序,未见内皮细胞增生,视野内未见明显炎性细胞浸润,毛细胆管未见胆汁淤积。模型组大鼠肝组织大块坏死,几乎见不到完整的肝小叶结构,肝索紊乱,肝细胞大片肿胀,变性及坏死,仅残留零星正常肝细胞,部分肝细胞溶解,细胞边界模糊,肝窦裂隙明显扩增,血管内皮细胞大量脱落,炎性细胞大量浸润,毛细胆管可见大量胆汁堵塞。JDHY组大鼠肝组织见点片状坏死,肝小叶结构欠完整,肝索条理尚清晰,肝细胞可见不同程度肿胀及变性,少部分肝细胞坏死,汇管区可见少许炎性细胞浸润,毛细胆管可见少许胆汁淤积。(2)CRNDE含量表达:与正常组相比,模型组及JDHY组CRNDE含量表达均下降(P0.05),差异具有统计学意义;与模型组相比,JDHY组CRNDE表达上升(P0.05),差异具有统计学意义。(3)PI3K、Akt、mTOR及CyclinD1蛋白表达:与正常组相比,模型组大鼠肝组织PI3K、Akt、mTOR及CyclinD1蛋白含量均降低(P0.05),差异具有统计学意义;与模型组相比,JDHY组大鼠肝组织PI3K、Akt、mTOR及CyclinD1蛋白含量均升高(P0.05),差异具有统计学意义。(4)TBiL、ALT、AST:与正常组相比,模型组TBiL、ALT、AST值明显升高(P0.05),差异具有统计学意义;与模型组相比,JDHY组TBiL、ALT、AST值均下降(P0.05),差异具有统计学意义。(5)TUNEL染色:与正常组相比,模型组及JDHY组肝组织细胞凋亡数目及凋亡率上升(P0.05);与模型组相比,JDHY组肝组织细胞凋亡数目及凋亡率下降(P0.05)。结论:1.临床研究:(1)肝衰竭患者血清CRNDE表达明显降低,与TBiL、PT、PTA呈负相关,CRNDE有拮抗肝衰竭的作用。(2)解毒化瘀颗粒可提高肝衰竭患者血清CRNDE表达,降低TBiL、ALT、AST水平,提高ALB水平,缩短PT,升高PTA,改善患者肝功能、凝血功能及证候评分,提高临床疗效。2.实验研究:(1)CRNDE在ALF大鼠肝组织中表达下降,与PI3K、Akt、mTOR及CyclinD1蛋白呈正相关,可促进ALF大鼠肝细胞增殖,抑制肝细胞凋亡,拮抗ALF。(2)解毒化瘀颗粒通过上调CRNDE及PI3K、Akt、mTOR、CyclinD1表达,促进ALF大鼠肝细胞增殖,抑制ALF大鼠肝细胞凋亡,从而发挥拮抗肝衰竭作用。