尿石素B抑制破骨细胞分化、改善去卵巢诱导骨丢失的作用及机制研究

作     者：屈泽超 

作者单位：延安大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闫亮

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：尿石素B 骨质疏松 破骨细胞 核因子κB受体活化因子配体 活性氧 

摘      要：背景:骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种由多种原因引起的系统性骨骼疾病,其特征是骨密度降低,骨组织微结构破坏,从而增加了骨骼的脆性和骨折的易感性。骨质疏松性骨折是OP的严重并发症,其危害巨大是老年患者致残和致死的主要原因。OP目前已经成为一个全球性的重大公共健康问题,受到了高度关注。破骨细胞(osteoclasts,OCs)的过度吸收与分化是诱发骨质疏松的主要病理原因。尿石素B作为鞣花酸的分解产物,具有更强的稳定性和更高的生物利用度。尿石素B具有潜在的抗炎、抗氧化和抗动脉粥样硬化等生物活性作用,其研究与开发受到广大科研工作者的重视。目的:(1)以核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导RAW264.7细胞建立体外OCs模型。探讨尿石素B对于OCs形成、分化及分子机制的影响。(2)建立体内去卵巢大鼠骨质疏松动物模型,检测尿石素B在体内对于卵巢切除诱导的大鼠骨丢失模型形态学影响。方法:(1)体外实验:用RANKL(40 ng/m L)独立诱导单核巨噬细胞系RAW264.7细胞向成熟OCs分化,并加入不同浓度的尿石素B(0、10、30、50、100μM)给予干预。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrated resistant acid phosphatse,TRAP)染色和细胞骨架纤维肌动蛋白(F-Actin)环染色,评估不同浓度尿石素B对于OCs分化及骨吸收功能的影响。通过蛋白免疫印迹和RT-PCR检测尿石素B对于OCs分化过程中核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)信号通路相关分子的影响,以及对于OCs分化特异性基因表达的影响。使用2,7-二氯二氢荧光素-乙酯乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)染色来检测不同浓度尿石素B对于OCs分化过程中ROS表达的影响。(2)体内实验:通过动物实验进行体内验证,以去卵巢大鼠诱导的骨质疏松动物模型作为研究对象,将32只SD雌性大鼠随机分为假手术组、卵巢切除(ovariectomy,OVX)+生理盐水组、OVX+低剂量尿石素B组(OVX+20mg/kg UB)、OVX+高剂量尿石素B组(OVX+60 mg/kg UB)。实验终点通过微型计算机断层(Micro computed tomography,Micro-CT)扫描各组大鼠股骨进行骨参数形态学评估,使用苏木精—伊红染色法染色对股骨远端骨组织切片进行组织学评估。探讨尿石素B在体内对卵巢切除大鼠骨质疏松模型的影响。结果:(1)建立RANKL诱导的体外成熟OCs模型。形态学上,尿石素B以剂量依赖的方式抑制RANKL诱导的OCs分化,抑制破骨细胞F-Actin环的生成,特别是在100μM浓度下抑制作用最明显。机制上,尿石素B抑制RANKL诱导的OCs分化下游NF-κB、MAPK和ROS关键信号分子的磷酸化,减弱NF-κB p65亚基的核移位。进一步,尿石素B抑制OCs分化特异性基因TRAP、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)、OCs刺激跨膜蛋白(Osteoclast stimulatory transmembrane protein,OC-STAMP)、基质金属肽酶-9(Matrix metallopeptidase-9,MMP-9)、c-Fos和活化T细胞核因子蛋白c1(Nuclear factor of activated T cells type c1,NFATc1)的表达。此外,尿石素B能够抑制破骨细胞ROS的产生,具有一定的抗氧化性能。(2)建立卵巢切除诱导的骨质疏松骨溶解大鼠动物模型。与OVX组相比较,尿石素B干预组能够增加卵巢切除引起的骨丢失,增加骨密度,骨小梁排列更加密集有序,受损的骨组织微结构得到明显改善。结论:尿石素B作为鞣花酸的分解产物,具有较高稳定性和生物利用度。尿石素B在体外细胞模型和体内动物实验中均表现出良好的抗骨质疏松特性。尿石素B能够通过抑制RANKL诱导的下游NF-κB、MAPKs和ROS通路相关分子的磷酸化,降低OCs分化特异性基因TRAP、CTSK、OC-STAMP、MMP-9、c-Fos和NFATc1的表达,抑制转录因子NF-κB p65亚基的核移位,阻止ROS的产生,最终抑制OCs的分化和成熟。体内实验中,尿石素B能够改善卵巢切除诱导的骨丢失,增加骨密度。尿石素B可能成为一种新的治疗骨质疏松骨溶解相关疾病的新策略。