Bt Cry2Aa毒素新型免疫分析方法的建立与研究

作     者：李懿航 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘贤金

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0828[工学-农业工程] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：单克隆抗体 单链抗体 酶联免疫分析方法 化学发光免疫分析方法 

摘      要：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）在其产孢过程中会分泌Cry毒素。其中Cry2Aa毒素在1981年首先被分离出来,它对鳞翅目和双翅目昆虫均有毒性。目前认为Cry毒素对哺乳动物无毒的原因在于其体内缺少针对Cry毒素的受体,因此近年来转Bt基因植物被广泛种植。但使用转基因作物来喂养动物,很容易造成转基因蛋白在哺乳动物体内堆积。转Bt产品也会存在很多风险,如对靶标生物的安全风险、由于导入外源基因对生态环境的影响以及潜在的入侵性等。目前现有报道的Cry2Aa免疫检测方法有基于噬菌体展示肽、纳米抗体及单链抗体的单一检测方法,除检测灵敏度及方法特异性的提升外,可以通过建立一套系统、完善的检测方法来检测转Bt基因作物中Cry毒素的表达水平及在食品中的残留量。本论文依托单克隆抗体制备、基因工程等技术获得Cry2Aa毒素的单克隆抗体及单链抗体,建立三种免疫分析方法并进行了比较。为了保证所建立的免疫方法的准确性,将检测方法应用到实际样品的检测中去。研究内容主要包括以下几个方面:（1）Cry2Aa毒素单克隆抗体的制备利用常规免疫手段对Balb/c雌性小白鼠进行免疫,其中将原毒素作为免疫原,由此可获得小鼠免疫脾细胞,随后将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,筛选单克隆抗体。选择能够稳定分泌Cry2Aa毒素抗体且灵敏度高的杂交瘤细胞株（1D2D11）产生单克隆抗体（m Ab）。经测定,所得到的单克隆抗体为高特异性抗体,重链亚型为Ig G1型,κ轻链,效价为6.4×10～5。可作为后续建立Cry2Aa毒素免疫分析方法的抗体材料。细胞株1D2D11由中国典型培养物保藏中心保藏,编号CCTCC NO:C2019188。（2）Cry2Aa毒素单链抗体的构建以上述的杂交瘤细胞株1D2D11作为基因来源,利用通用引物PCR扩增出V及V,随后通过SOE-PCR构建单链抗体（sc Fv）全长基因序列并测序。将sc Fv基因转到载体PET-26b中后,在大肠杆菌*** BL21中进行表达。经过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况,并通过间接ELISA鉴定sc Fv的活性。随后将成功表达的sc Fv进行生物素酰化,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定是否标记成功,并鉴定酰化后的sc Fv的结合活性。结果表明,V和V基因序列扩增成功,并且完整的构建了sc Fv基因序列。sc Fv成功标记后仍保持着原单克隆抗体具有的结合活性。sc Fv的构建为免疫分析技术提供了新的抗体材料。（3）Cry2Aa毒素酶联免疫方法研究利用上述制备的抗体建立了Cry2Aa毒素ic-ELISA和DAS-ELISA检测方法,并相应的优化了包被原、抗体的工作浓度。在最优浓度下建立了Cry2Aa毒素酶联免疫吸附方法的标准曲线。在ic-ELISA方法中,抑制中浓度(IC)为10.65μg/m L,线性范围(IC-IC)为1.11-60.70μg/m L,最低检出限(IC)为1.05μg/m L。该方法除与Cry1B（CR=8.8%）存在一定交叉反应外,与其他Cry毒素的交叉反应均小于0.1%。在DAS-ELISA方法中,LOD和LOQ的值分别为10.76和20.70 ng/m L,SC为0.358μg/m L,与Cry1B的交叉反应率为3.1%。分别优化水稻、玉米、大豆三种基质,并在其中添加Cry2Aa毒素进行添加回收试验。利用制备的sc Fv抗体建立Cry2Aa毒素的DAS-ELISA方法,在捕获抗体、检测抗体的最优浓度下,建立相应的标准曲线,LOD和LOQ的值分别为118.75和633.48ng/m L,SC为0.749μg/m L,与Cry1B的交叉反应率为3.2%。在确定基质效应减弱或消除后,进行添加回收试验。结果表明,利用单抗建立的检测方法中,DAS-ELISA的灵敏度与ic-ELISA相比提高了100倍左右。而所建立的酶联免疫吸附方法检测结果准确、可靠,可应用于检测转基因植物中的Cry2Aa毒素。（4）Cry2Aa毒素化学发光酶联免疫分析方法研究以化学发光体系作为免疫反应信号的检测形式,利用所制备的单克隆抗体及单链抗体建立相应的化学发光酶联免疫分析方法（CLEIA）。确定该方法下的捕获抗体和检测抗体的浓度。当单克隆抗体为检测抗体时,LOD和LOQ的值分别为6.10和7.40ng/m L,SC为0.161μg/m L,与Cry1B的交叉反应率为12.4%;当单链抗体作为检测抗体时,LOD和LOQ的值分别37.47和70.23 ng/m L,SC为0.197μg/m L,与Cry1B的交叉反应率为19.3%。分别在水稻、大豆、玉米三种基质中进行添加回收率试验。结果表明,CLEIA的灵敏度相对于DAS-ELISA存在明显的提升。建立