基于胃肠微生物调控的小建中汤治疗慢性萎缩性胃炎大鼠的作用机制研究

作     者：廉旭 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘月涛

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：小建中汤 慢性萎缩性胃炎 代谢组学 抗生素 胃肠道菌群 关联分析 

摘      要：选题依据:小建中汤出自《伤寒论》,由饴糖和桂枝、白芍、生姜、大枣和炙甘草五味中药组合而成,主要用于中焦虚寒、肝脾不协调所引起的腹部疼痛的治疗。现代临床多将其用于治疗慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)等胃肠疾病,效果确切。但目前对小建中汤治疗CAG的作用机制研究还较为缺乏,多是对其药效的初步评价。代谢组学是研究生物体系在生命过程中受到外界干预后机体代谢物的变化规律及其与生物学功能关系的技术手段。利用代谢组学技术可以对机体在疾病状态及药物治疗后体内代谢物的变化情况进行监测,从而为阐释药物作用机制提供数据支持。同时,CAG作为一种消化系统疾病,与菌群有着密不可分的关系。胃部并非是无菌环境,在疾病状态下胃部的菌群呈现出丰富的多样性;结肠是整个大肠中占比最多的部位,是微生物菌群最丰富的肠段。因此对胃液和结肠内容物微生物群落进行研究,能够更加全面地反映CAG疾病状态下及小建中汤治疗后的微生物差异。将代谢组学与微生物组学技术相关联,可以深入研究胃肠道菌群与机体代谢的关系,为阐明小建中汤的药效及作用机制开启了一个新思路。目的:本研究以CAG大鼠为动物病理模型,以小建中汤为治疗药物,联合代谢组学技术与16S rRNA技术,从“小建中汤-CAG-胃肠道菌群三方面出发,研究小建中汤治疗CAG的潜在作用机制。方法:(1)首先构建CAG大鼠模型,用于小建中汤低剂量组和高剂量组的药效评价,另外设置阳性药组、模型抗生素干扰组、小建中汤低剂量抗生素组和小建中汤高剂量抗生素组,外加空白组。造模期间观察记录大鼠的外观状态和体重的变化,检测胃液pH、胃蛋白酶活性、血清TNF-α、IL-6和总胆汁酸的含量变化情况,并进行了胃窦组织的病理切片。同时,采用微量比浊法对抗生素对胃肠道菌群的抑制效果进行了检测。随后,综合考察传统药效学的药效,比较高低剂量的优劣。并且利用液相色谱-质谱联用技术分别对胃液和结肠内容物进行代谢组学分析,获取差异代谢物,综合评价小建中汤的药效。根据抗生素组代谢物含量的变化情况,推测代谢物含量变化是来自于小建中汤的直接调控还是小建中对菌群调控导致的间接作用。(2)使用16S rRNA高通量测序技术,分析各组大鼠的胃液及结肠内容物菌群的变化情况,定位得到具有显著差异的菌种,研究小建中汤对CAG大鼠菌群结构的影响。(3)对代谢组学获得的差异代谢物和16S rRNA高通量测序得到的差异菌种进行Spearman相关性分析,筛选出具有强相关性的差异代谢物-差异菌种相关对,随后分析各相关对之间可能存在的作用,最后采用分子对接技术对其互作中所涉及蛋白进行初步验证。结果:(1)药效学结果显示,模型组大鼠皮毛枯黄、尾巴颜色偏白色、精神状态萎靡以及对外界刺激反应小,同时胃液pH值升高,胃蛋白酶活性降低,胃黏膜萎缩且有炎症发生,血清TNF-α、IL-6和总胆汁酸的含量均显著升高,表明模型复制成功。给予小建中汤干预后,各项指标均可观察到显著的回调,高剂量组效果优于低剂量组。抗生素对给药组进行干预后,回调效果有所下降,表明菌群在小建中汤发挥药效过程中起到了重要作用。微量比浊法检测结果表明,抗生素干预后,大鼠粪便菌群含量显著减少。且增殖速度明显降低。代谢组学结果表明:与C组相比,在M组中,胃液中共有14个差异代谢物,小建中汤治疗后可回调7个差异代谢物,推测小建中汤可直接调控其中2个代谢物,而通过调节菌群影响其余5个代谢物。结肠内容物中共有19个差异代谢物,有11个小建中汤治疗后可显著回调,推测其中有4个代谢物被小建中汤直接调控,有1个受小建中汤和菌群的共同调控,其余6个代谢物的变化来自小建中汤对菌群的间接调控。(2)16S rRNA测序结果显示,CAG大鼠胃肠道菌群均发生了显著变化。其中,胃液中共有3个门,4个科,6个属和6个种的菌群发生了显著变化,给药后可显著回调其中1个门,3个科,4个属和5个种的菌群丰度。结肠内容物中有3个门,8个科,9个属和9个种的菌群发生了显著变化,给药后可以回调1个门,3个科4个属和5个种的菌群丰度。说明CAG的发病与胃肠道菌群紊乱关系密切,而小建中汤治疗可以改善这种菌群紊乱的状态。(3)通过Spearman相关性分析,找寻代谢组与微生物组之间的关联关系,其中在胃液当中r大于|0.6|的强相关对有9对。而在结肠内容物当中r大于|0.6|的强相关对有16对。随后收集小建中汤各单味药的有效成分,并对强相关对中可能存在“小建中汤-代谢物,“小建中汤-菌群调控作用所涉蛋白靶点进行分子对接验证,推测小建中汤有效成分可调控L-Tyrosine、L-Phenylalanine、PE(17:0/0:0)、Cervonoyl ethanolamide、Glycocholic acid、Urocanic acid和Tyr