Chemerin敲除对高脂喂养雄性小鼠非酒精性脂肪肝的影响及运动的改善作用

作     者：张荣荣 

作者单位：上海体育学院 

学位级别：硕士

导师姓名：王晓慧

授予年度：2023年

学科分类：0403[教育学-体育学] 040302[教育学-运动人体科学(可授教育学、理学、医学学位)] 04[教育学] 

主      题：chemerin 有氧运动 非酒精性脂肪肝 脂代谢关键酶 

摘      要：研究目的:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种常见的慢性肝脏疾病,全球约有10%-30%的成年人患有NAFLD,其特征为非长期大量饮酒和其他明确损肝因素所引起的,以甘油三酯为主的脂质在肝细胞中蓄积导致肝脏病理改变的代谢性疾病。脂肪因子chemerin与NAFLD的发生发展密切相关。研究表明NAFLD患者或NAFLD大、小鼠的血清chemerin水平显著增高,且增加水平与肝脏脂肪变性程度相关。Chemerin主要与其受体趋化因子样受体1(Chemokinelike receptor-1,CMKLR1)结合来实现其调控糖脂代谢等生物学功能。运动、饮食干预或减重手术治疗NAFLD时,常伴随着chemerin/CMKLR1水平的下降。本课题组的前期研究发现,脂肪chemerin敲除可通过调控糖脂代谢关键酶和关键蛋白的水平来改善高脂饮食小鼠的糖脂代谢,但chemerin是否能调控高脂饮食小鼠NAFLD的发生发展、且该作用是否也与脂肪代谢相关酶有关,目前仍未被阐明。本研究的第一个目的是利用脂肪特异性chemerin敲除小鼠和全身性chemerin敲除小鼠来阐明基础状态下chemerin是否影响NAFLD的发生。众多文献已报道,运动调控肝脏的脂代谢关键酶活性、促进肝脏脂肪氧化分解、减少肝内脂肪合成和转运,是改善NAFLD的重要途径。我们课题组前期研究发现,有氧运动所致chemerin减少可以通过影响糖脂代谢关键酶来改善糖脂代谢紊乱。由此,我们推测chemerin减少在运动改善小鼠NAFLD中的作用很可能也是通过调控肝脏脂代谢关键酶活性实现的。因此,本研究的第二个目的是明确chemerin在运动调控NAFLD中的作用、并探讨其作用机制是否与肝脏脂肪代谢关键酶水平有关。研究方法1.Chemerin敲除小鼠的构建和小鼠分组委托上海南方模式生物技术公司采用cre-loxp系统构建脂肪特异性chemerin敲除和全身性chemerin敲除小鼠。待小鼠两周龄时,剪取鼠尾进行DNA检测筛选出敲除小鼠,8周龄时检测脂肪、肝等的chemerin蛋白水平,进行敲除验证。将8周龄雄性野生型(WT)小鼠、脂肪chemerin敲除纯合子[adipo-chemerin(-/-)]小鼠和全身性chemerin敲除纯合子[chemerin(-/-)]小鼠,随机分为普通饮食(ND)组和高脂饮食(HFD)组,进行12周饮食干预,得到ND和HFD下的WT、adipo-chemerin(-/-)和chemerin(-/-)组小鼠。此外,将HFD小鼠分为运动对照组(WT+E),adipo-chemerin(-/-)+E和chemerin(-/-)+E组,高脂喂养6周后进行6周中等强度跑台运动,每周运动6天、每天1次。2.小鼠NAFLD情况及肝脏代谢酶等的检测检测各组小鼠的体重、肝脏重量,赖氏微板法检测血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)含量,HE染色和油红O染色检测小鼠肝脏脂肪变性情况。Western blot方法检测小鼠肝脏多个脂肪代谢关键酶,包括脂肪转位酶(cluster of differentiation 36,CD36)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptorα,PPARα)、肉碱棕榈酰基转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)、甾醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding proteins-1,SREBP-1)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl‐Co A desaturase1,SCD1)的蛋白水平。研究结果1.基础状态,chemerin敲除对普通和高脂饮食喂养雄性小鼠NAFLD的影响(1)chemerin敲除对普通饮食小鼠的影响:WT小鼠和两种chemerin敲除小鼠的肝脏形态结构正常,未出现明显病理性变化。两种chemerin敲除对肝脏脂肪代谢相关酶的表达无明显影响,但chemerin(-/-)小鼠与adipo-chemerin(-/-)小鼠相比,脂肪合成蛋白SCD1的蛋白水平上调(P0.05)。(2)chemerin敲除对高脂饮食小鼠的影响:与WT小鼠比较,adipochemerin(-/-)小鼠肥胖率下降,肝脏重量与体重比值下降(P0.05),肝脏脂肪空泡和脂滴数量减少,血清ALT、AST含量均降低(P0.05),表明HFD喂养的adipo-chemerin(-/-)小鼠NAFLD改善;但chemerin(-/-)小鼠的肥胖率升高,脂肪空泡数量增多并出现气球样变性,提示肝脏脂肪变性恶化。在糖脂代谢酶的蛋白水平上,相对于WT组,adipo-chemerin(-/-)小鼠的肝脏脂肪转运蛋白CD36、脂肪合成蛋白SREBP-1和SCD1的水平均显著下调(P0.05),氧化分解限速酶CPT-1的表达水平上调(P0.05);而chemerin(-/-)小鼠与adipo-chemerin(-/-)小鼠相反,CD36、SREBP-1表达上调(P0.05)。chemerin(-/-)小鼠与adipo-chemerin(-/-)小鼠相比,CD36、SREBP-1、SCD1蛋白表达显著上调(P0.01)、CPT-1水平下降(P0.05)。2.运动状态,chemerin减少对高脂饮食喂养雄性小鼠NAFLD的影响及机制(1)chemerin全敲对高脂饮食运动小鼠的影响:6周有氧运动显著降低了WT小鼠和chemerin(-/-)小鼠的肝脏重量及肝比重(P0.05),减少WT和chemerin(-/-)小鼠的脂肪空泡和脂滴数量,降低WT小鼠和chemerin(-/-)小鼠的血清ALT含量(P0.05)、AST含量(分别是P0.01和P0.05),但chemerin(-/-)小鼠的AST含量下降幅度小于WT。在糖脂代谢酶的蛋白水平上,6周有氧运动降低了WT小鼠肝SREBP-1、SCD1(P0.05)和CD36水平(P0.01),升高了CPT-1水平(P0.05),但运动仅降低了chemerin(-/-)小鼠CD36水平(P0.01),对其余代谢酶的蛋白水平无显著影响。以上结果提示运动对高脂饮食小鼠NAFLD的改善作用与其调控肝脏脂代谢关键酶(SREBP-1、SCD1、CD36、CPT-1)有关,chemerin全敲减弱或丧失了对肝脏脂代谢关键酶的调控作用,从而减弱了运动对高脂饮食小鼠NAFLD的改善作用。(2)脂肪chemerin敲除对高脂饮食运动小鼠的影响:6周有氧运动减少了高脂饮食WT和adipo-chemerin(-/-)小鼠肝脏的脂质堆积,改善了肝脏的形态结构;6周有氧运动可以显著降低WT小鼠的血清ALT、AST含量(P0.05,P0.01)以及adipo-chemerin(-/-)小鼠的血清AST含量(P0.01)。在糖脂代谢酶的蛋白水平上,6周有氧运动降低了WT小鼠肝CD36、SREBP-1水平(P0.05,P0.01),升高CPT-1水平(P0.05);6周有氧运动进一步减少了adipo-chemerin(-/-)小鼠CD36和SCD1的蛋白水平、并升高CPT-1水平(P0.01)。以上结果提示脂肪chemerin敲除增强了对肝脏脂代谢关键酶的调控作用,并进一步增强了运动对高脂饮食小鼠NAFLD的改善作用。研究结论1.基础状态下,chemerin减少可以改善雄性高脂饮食小鼠的NAFLD,但chemerin过低则加重其NAFLD;chemerin的该作用通过调控肝脏脂代谢关键酶(SREBP-1、SCD-1、CD36、CPT-1)实现。2.运动干预后,脂肪chemerin敲除增强了运动对高脂饮食小鼠NAFLD的改善作用、而chemerin全敲则减弱了运动效应;该作用与脂肪chemerin敲除和chemerin全敲分别增强和减弱对肝脏脂代谢关键酶的调控作用有关。