多浪羊Lin28B基因在初情期启动过程中的功能及转录调控研究

作     者：隋志远 

作者单位：塔里木大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邢凤

授予年度：2023年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：多浪羊 初情期 Lin28B启动子 转录因子 甲基化 

摘      要：初情期是雌性动物首次出现发情表现并排卵的关键时期,在动物生命周期中具有至关重要的作用,是雌性动物获得繁殖能力的一个重要标志,其发生时间直接影响着动物的繁殖能力。前期课题组初步探究了Lin28B基因与多浪羊的初情期启动有一定的关系。所以本研究继续将Lin28B作为候选基因去探索Lin28B基因和初情期启动之间的关系。本研究将在前期课题组试验的基础上,通过所得到的多浪羊的CDS区序列构建了过表达的载体转染至绵羊卵巢颗粒细胞中,检测Lin28B基因过表达后对其相关通路基因的影响,从而初步分析Lin28B基因在绵羊卵巢颗粒细胞中的作用。其次,本研究克隆了Lin28B基因启动子区序列并进行生物信息学分析,构建了Lin28B基因启动缺失载体初步了解了启动子的结构与功能。最后,本研究通过分析多浪羊下丘脑甲基化状态与转录因子SP1、Egr1来进一步阐明对Lin28B基因的转录调控作用。本研究的主要结果如下:本研究通过构建多浪羊Lin28B基因CDS区序列的载体,并将其转染至绵羊卵巢颗粒细胞中,发现Lin28B过表达抑制了其通路基因Let7-b和Let7-g的表达,同时促进了雌二醇的分泌和绵羊卵巢颗粒细胞的增殖。本研究克隆了多浪羊Lin28B启动子区3?000 bp,并通过生物信息学分析发现,该序列中存在1个Cp G岛,存在4个转录起始位点,并且包含多个与初情期转录调控相关的转录因子。本研究还构建了启动子缺失片段载体,通过双荧光素酶检测发现,Lin28B基因的核心启动子区位于-837～-338 bp,同时核心启动子区存在SP1、Egr1等多个与初情期调控相关转录因子。通过亚硫酸氢盐测序(BSP)方法,本研究对多浪羊下丘脑Lin28B基因启动子区Cp G岛的甲基化进行了检测。采用荧光定量PCR方法检测了Lin28B在多浪羊下丘脑三个阶段初情期前、初情期和初情期后的表达量。结果表明,从初情期前到初情期后,甲基化水平增加,而Lin28B表达水平下降,表明Lin28B表达与启动子甲基化水平呈负相关。方差分析显示,在初情期前到初情期后,Cp G5、Cp G 7和Cp G9的甲基化状态存在显著差异(P0.05)。本试验数据表明,Lin28B的表达通过启动子Cp G岛的去甲基化而增加,其中Cp G5、Cp G7和Cp G9被认为是关键的调控位点。本研究构建了SP1和Egr1点突变载体及Egr1过表达载体,通过双荧光素酶检测发现,缺失SP1或者Egr1单个转录因子,Lin28B启动子的转录活性显著降低,其中Egr1突变后转录活性下降的更为显著;通过过表达Egr1载体可以看出,Lin28B基因启动子的活性显著升高。因此,初步推断转录因子SP1和Egr1对Lin28B基因的转录调控具有重要的作用。综上所述,本研究表明了,Lin28B基因在绵羊卵巢颗粒细胞中过表达后对Let7-b、Let7-g及雌二醇有一定的影响。并且本研究也表明,甲基化状态和转录因子SP1、Egr1对可以直接影响Lin28B基因的转录。因此,本研究阐明了甲基化状态和转录因子SP1、Egr1参与调控Lin28B基因转录的调控机制,从而为绵羊Lin28B基因对初情期启动调控的机制提供理论基础。