具核梭杆菌调控miR-122-5p表达与外泌体分泌在结直肠癌转移中的作用及机制研究

作     者：张梦姣 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张欣

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：具核梭杆菌 miR-122-5p 外泌体 上皮间质转化 结直肠癌转移 

摘      要：背景:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最为常见的消化道恶性肿瘤之一,已成为全球发病率第三,死亡率第二的癌症,严重威胁着人类健康。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一种小的非编码RNA,已被证明可以在转录后水平调节靶基因的表达。越来越多的证据表明,miRNAs的异常表达和功能异常参与了包括CRC在内的许多癌症的病理生理过程。目前,肠道菌群已被证明与结直肠癌的发生具有相关性。其中,已有研究表明具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)可诱导结肠中的促炎状态,从而导致癌症的发生。据报道,Fn可以通过调节多种致癌miRNAs的表达影响结直肠癌的发生发展,但对抑癌miRNAs的影响了解较少。因此深入探讨Fn对miRNAs的调控作用有助于揭示CRC的发病机制。目的:探究Fn对结直肠癌细胞miRNAs的表达调控作用,解析Fn促进结直肠癌转移的作用机制,为CRC预防及治疗提供新思路和治疗手段。方法:***分别与SW480及HCT116细胞共培养,建立Fn感染结直肠癌细胞模型。超速离心法提取Fn感染结直肠癌细胞来源的外泌体。高通量测序分析具有不同Fn丰度的结直肠癌患者血清外泌体,以及感染与未感染Fn细胞培养液上清外泌体中miRNAs表达谱,并对上述两个测序结果取交集,筛选出差异表达最明显的miRNA。2.利用逆转录实时荧光定量技术(Reverse Transcription Quantitative PCR,RT-qPCR)进一步验证感染细胞模型中感染组与未感染对照组中外泌体miR-122-5p的表达。***-qPCR检测miR-122-5p在CRC临床样本中的表达。4.体外分别使用transwell实验及细胞划痕实验来评估不同处理组对结直肠癌细胞侵袭、迁移的影响。体内通过脾注射构建结直肠癌肝转移模型,以评估上述不同处理组对结直肠癌转移的影响。5.通过对Fn感染阳性的结直肠癌组织中升高的mRNAs及联合miR-122-5p靶基因的生物信息学预测,筛选出Fn感染的结直肠癌细胞中发挥作用的下游靶点。6.双荧光素酶实验验证miR-122-5p对FUT8的调控关系。7.检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中的FUT8表达及Fn感染与未感染对照组结直肠癌中FUT8的表达。8.分别过表达或抑制miR-122-5p和FUT8的表达,通过Western blot和RT-qPCR检测EMT相关指标的变化。结果:1.两组高通量测序分析结果显示miR-122-5p在具有高、低Fn丰度的结直肠癌患者血清外泌体及感染、未感染Fn的细胞来源的外泌体中差异表达,且均上调表达。2.在Fn感染阳性的结直肠癌患者中,miR-122-5p的表达在血清与组织中呈显著的负相关。血清外泌体miR-122-5p高表达与CRC患者淋巴结转移及远处转移存在相关性。3.体外实验表明,过表达miR-122-5p显著减低了结直肠癌细胞迁移和侵袭的潜能。体内实验表明,miR-122-5p过表达处理使小鼠肝转移肿瘤结节数目显著下调,抑制miR-122-5p表达会导致相反的结果。***-qPCR结果证实,Fn感染导致结直肠癌细胞外泌体中miR-122-5p升高,但细胞内水平呈现下调。表明Fn感染促进癌细胞内肿瘤抑制性的miR-122-5p以外泌体包裹的形式排出。*** 结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)hnRNPA2B1 介导外泌体包裹的miR-122-5p的胞外转运过程。6.双荧光素酶实验证实FUT8是miR-122-5p发挥作用的靶基因。RT-qPCR和Western blot验证了结直肠癌细胞中FUT8表达与miR-122-5p表达之间的负相关关系。FUT8可以部分逆转miR-122-5p对结直肠癌细胞的抑制作用。7.机制上,miR-122-5p的下调导致了FUT8水平的升高,上调Smad2/3蛋白水平及EMT相关标志物水平。结论:***感染促进结直肠癌细胞内肿瘤抑制性的miR-122-5p以外泌体包裹的形式排出胞外,导致胞内miR-122-5p水平降低。***感染导致的癌细胞内降低的miR-122-5p解除对下游靶基因FUT8的抑制,激活了 TGF-β1/Smads信号通路,诱导EMT,从而促进CRC转移。