通过光照响应非编码RNA解析斑马鱼生物钟的复杂调控机制

作     者：王左 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵海谕

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071008[理学-发育生物学] 

主      题：光照 生物钟 斑马鱼 全转录组测序 miRNA 非编码RNA 竞争性内源RNA 

摘      要：绝大多数生物都拥有能够预测昼夜周期性循环的生物钟系统,并且能被环境中的光照重置。这一重要生物过程由光照响应基因所调控,然而迄今为止人们对生物钟系统复杂的调控机制仍不完全了解。斑马鱼模型是解决这一问题的优势工具,它已被大量用于脊椎动物生物钟系统的研究。与哺乳动物不同,斑马鱼外周组织、细胞及体外培养细胞系中的生物钟系统可直接受到光照调控,这为探究光照影响的生物学功能及机制提供了独特的研究模型。本研究中,我们利用RNA测序技术鉴定并筛选出了1365个光照响应m RNA和66个光照响应mi RNA。功能富集分析显示,光响应m RNA主要参与氧化还原、视觉感知、PPAR信号通路、光转导和过氧化物酶体等生物学功能,而光响应mi RNA能够参与调控MAPK(mitogen-activated protein kinase)和过氧化物酶体(peroxisome)等与昼夜节律密切相关的信号通路和生物学功能。根据K-mean聚类分析和m RNA-mi RNA互作分析,我们构建了斑马鱼生物钟的转录后调控网络,并发现了两个可能调控核心时钟元件隐花色素(cry1a和cry1b)的光照响应mi RNA(mi R-204-3p和mi R-430a-3p),并且围绕这两个mi RNA展开深入的功能研究。双荧光素酶报告基因实验验证了mi R-204-3p和mi R-430a-3p分别具有靶向结合cry1a和cry1b的3’-UTR的能力。随后我们对斑马鱼胚胎显微注射mi RNA类似物(mi RNA mimics)和mi RNA抑制剂(mi RNA inhibitor)并在活体水平上探究了mi R-204-3p和mi R-430a-3p的功能。q RT-PCR检测证实mi R-204-3p和mi R-430a-3p能够显著抑制靶基因(cry1a和cry1b)的表达,并且可能通过间接影响其它多个核心时钟基因(bmal1b、clock1a、per1b、per2、per3)的表达而调控整体核心时钟机制。由于节律性活动是生物钟最重要的输出形式,我们推测这mi R-204-3p和mi R-430a-3p可能会影响斑马鱼的节律活动。因此我们对过表达、干扰mi RNA的斑马鱼幼鱼进行了多项行为学检测,结果显示mi R-204-3p和mi R-430a-3p会显著影响其在光照-黑暗周期及恒暗(Free-Running period)条件下的节律活动。此外,基于全转录组测序数据,我们还筛选与鉴定到了330个光照响应lnc RNA和71个光照响应circ RNA。根据ce RNA调控机制,我们初步构建m RNAmi RNA-lnc RNA-circ RNA的四元调控网络,并进一步筛选出生物钟系统相关基因(cry1a、cry1b、cry2、aanat1、dbpb、cry5、nfil3-6、tefa和nr1d2a)的ce RNA子网络,以探索非编码RNA介导的生物钟系统转录后调控机制。该分析结果对阐明光照响应非编码RNA如何参与调控生物钟系统具有重要意义的指导意义。综上所述,本研究通过对斑马鱼光照响应m RNA和mi RNA进行筛选鉴定和功能验证,发现mi R-204-3p和mi R-430a-3p能通过靶向结合cry1a和cry1b,在分子和行为学水平影响生物钟系统。同时非编码RNA的生物信息学分析证实了光照对昼夜节律系统的调控是复杂和多层次的。本研究也为进一步探究昼夜节律系统中非编码RNA介导的转录后调控机制提供了新的信息与资源,为以后深入的机制研究奠定研究基础。