大肠杆菌中5-甲基胞嘧啶结合蛋白的鉴定及其功能研究

作     者：吉永琴 

作者单位：湖南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：游常军

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：大肠杆菌 5-甲基胞嘧啶 二甲基标记 robA蛋白 DNA转录 

摘      要：5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)是一种重要的表观遗传修饰。在真核生物中,5mC的结合蛋白在基因表达调控、染色质重塑和表观遗传记忆维持等生物学过程中发挥重要作用。然而,在原核生物中,鲜有关于5mC结合蛋白的报道。为了进一步了解原核生物中5mC的结合蛋白及其生物学功能,本论文以模式生物大肠杆菌为研究对象,通过基于二甲基标记的定量蛋白质组学方法,鉴定大肠杆菌DNA中5mC的潜在结合蛋白,并研究其对DNA转录的影响。主要研究内容及结果如下:(1)通过基于二甲基标记的定量蛋白质组学方法,对大肠杆菌DNA中5mC的潜在结合蛋白进行鉴定。首先,利用带生物素修饰的5mC双链探针富集5mC的潜在结合蛋白。然后,利用二甲基标记试剂对胰酶消化后的肽段进行轻、重同位素标记,并利用这种质量差异标签对肽段样品进行生物质谱检测与分析。最终,筛选出 5mC 的潜在结合蛋白 robA(MDR efflux pump AcrAB transcriptional activator RobA)和 hup A(DNA-binding protein HU-alpha)。(2)体外验证5mC与其潜在结合蛋白robA和hupA的结合关系。首先,构建带有GST标签的蛋白表达载体,并将其转入大肠杆菌感受态进行过表达。然后,通过基于DNA下拉和蛋白质免疫印迹技术的DNA-蛋白互作实验发现,robA蛋白与DNA探针中的5mC可以直接相互结合,而hupA蛋白与5mC探针无直接的相互结合关系。(3)robA基因敲除菌株的构建及其对DNA转录过程的影响研究。首先,利用基于CRISPR/Cas9基因编辑的单质粒系统和Golden Gate方法,构建含有靶向robA基因的向导DNA和修复模板供体DNA的质粒,并将该重组质粒转入大肠杆菌感受态中进行基因编辑。然后,通过挑取单克隆菌株进行PCR测序分析,我们获得了 robA基因敲除菌株(ΔrobA菌株)。此外,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)和正丁醇的耐受性实验验证了ΔrobA菌株的成功构建。最后,利用qRT-PCR技术结合前期发表的转录组测序数据分析,我们进一步研究了含5mC甲基化基序的基因在ΔrobA菌株中的mRNA转录水平,结果显示:robA蛋白的功能丧失可以显著影响这些基因的表达水平。综上,本论文利用基于二甲基标记的定量蛋白质组学方法,结合DNA-蛋白互作的体外验证实验,首次发现大肠杆菌中的robA蛋白可以与DNA中5mC相互结合。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术,结合qRT-PCR表达分析及前期发表的转录组学测序数据分析,我们发现robA蛋白可能在含5mC甲基化基序的基因表达调控过程中发挥重要作用。这些研究结果有助于进一步理解DNA甲基化修饰在大肠杆菌细胞中的生物学效应。