华蟾素调控Kv1.5通道影响胃癌缺氧微环境抑制其迁移与侵袭的作用及初步机制

作     者：涂雅婷 

作者单位：安徽中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李庆林

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：华蟾素 肿瘤缺氧微环境 胃癌 转移 Kv1.5 

摘      要：胃癌(Gastric cancer)是临床常见的消化系统肿瘤之一。目前胃癌的主要治疗方法是手术切除病灶后辅助放化疗和传统药物,但放化疗以及传统药物引起的胃损伤严重,胃癌患者的生存质量很难得到保障。因此,亟需寻找更多对胃癌患者有效的药物。胃癌的发生、发展、扩散及转移与其微环境密切相关。缺氧是肿瘤微环境(Tumor micro-environment,TME)不容忽视的特征之一,肿瘤细胞为适应缺氧会增强其干细胞样特性,形成更具侵袭性和耐药性的肿瘤表型,使得肿瘤细胞上皮向间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),进而促进肿瘤细胞侵袭转移,并表现出更多的恶性行为(如抵抗凋亡、治疗耐药等)。值得注意的是,离子通道和转运蛋白也与肿瘤缺氧微环境密切相关,如酸性p H、代谢变化等。因此,调控离子通道可能成为治疗癌症的靶点。Kv1.5通道是由KCNA5基因编码的一种跨膜蛋白,它可作为氧传感器改变细胞内钾离子水平以适应氧化还原状态的变化,有助于调节缺氧条件下的细胞增殖和存活。近年来有许多研究表明,在许多肿瘤中,Kv1.5通道蛋白与正常细胞相比异常表达,其在胃癌中的表达明显增多。提示Kv1.5与胃癌的发生、发展密切相关,因此有必要深入研究Kv1.5与胃癌进展之间的分子机制。目前,华蟾素(Cinobufagin)广泛用于临床抗肿瘤。多项研究表明,华蟾素不仅能抑制肿瘤血管生成改善肿瘤微环境,还参与调控离子通道。本研究通过建立胃癌缺氧模型,探究华蟾素对胃癌缺氧微环境的影响及Kv1.5通道在华蟾素抑制胃癌迁移与侵袭中的作用及初步机制。目的:研究华蟾素对胃癌缺氧微环境的影响及其抑制胃癌细胞增殖与侵袭转移的作用机制,阐明Kv1.5通道在华蟾素影响胃癌缺氧微环境抑制胃癌迁移与侵袭中的作用。方法:体内建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察并记录瘤体大小变化;免疫组化及ELISA试剂盒分别检测胃癌裸鼠移植瘤和血清中HIF-1α含量;通过HE染色观察华蟾素对胃癌移植瘤和心脏的影响,免疫组化检测胃癌增殖与EMT相关蛋白变化;体外构建缺氧人胃癌MGC-803细胞模型,CCK-8实验筛选华蟾素对缺氧胃癌细胞的作用浓度;Western blot检测华蟾素对缺氧人胃癌细胞MGC-803中缺氧诱导因子表达水平的影响;细胞划痕愈合实验和Transwell实验检测华蟾素对缺氧胃癌细胞的迁移与侵袭能力的影响;Western blot检测华蟾素对缺氧胃癌细胞中EMT相关蛋白表达水平的影响;Western blot及免疫组化分别检测华蟾素在体内外对缺氧胃癌细胞Kv1.5通道蛋白水平的影响;CCK-8实验检测抑制Kv1.5通道对缺氧胃癌细胞存活率的影响;Western blot实验检测抑制Kv1.5通道对缺氧胃癌细胞HIF-1α水平的影响;细胞划痕愈合实验和Transwell实验检测抑制Kv1.5通道对缺氧胃癌细胞的转移能力的影响;Western blot实验检测抑制Kv1.5通道对缺氧胃癌细胞EMT的影响。结果:1.华蟾素影响胃癌缺氧微环境抑制胃癌移植瘤EMT(1)通过建立胃癌裸鼠移植瘤模型,以5-FU为阳性对照药,观察华蟾素对胃癌移植瘤的影响,结果表明华蟾素抑制胃癌移植瘤生长(P0.05);(2)免疫组化及ELISA试剂盒分别检测裸鼠瘤体和血清中HIF-1α水平,结果表明华蟾素抑制胃癌HIF-1α的表达(P0.05);(3)HE染色和免疫组化结果阐述了华蟾素抑制胃癌细胞在裸鼠体内的增殖与EMT。2.华蟾素影响胃癌缺氧微环境抑制胃癌细胞MGC-803迁移与侵袭(1)通过细胞形态学观察缺氧时长对MGC-803形态的影响。结果发现,随着缺氧时间延长,细胞形态逐渐变得细而长。24h时细胞的增殖数量及状态最好,随后细胞形态开始变圆,并逐渐漂浮死亡;(2)CCK-8实验检测缺氧时长对MGC-803存活率的影响,该结果与细胞形态学一致,结果表明1%的氧浓度培养24h时细胞存活率最高,状态最好;(3)细胞划痕实验和Transwell实验检测1%的氧浓度培养24h对MGC-803迁移和侵袭能力的影响,结果显示1%的氧浓度培养24h明显促进胃癌细胞迁移与侵袭(P0.05),该实验证实1%的氧浓度培养MGC-803 24h适用于模拟胃癌缺氧微环境中胃癌细胞的缺氧状态;(4)CCK-8检测华蟾素对缺氧MGC-803存活率的影响,结果表明华蟾素抑制缺氧胃癌细胞的增殖(P0.05),IC为8.4 mg/m L;(5)Western blot检测华蟾素对缺氧MGC-803中HIF-1α的影响,结果表明华蟾素抑制HIF-1α的蛋白表达(P0.05);(6)细胞划痕实验和Transwell实验检测华蟾素对缺氧胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响,结果表明华蟾素抑制缺氧胃癌细胞迁