基于原位滚环扩增的脑胶质瘤基因突变的可视化分型方法
作者单位：北京工业大学
学位级别：硕士
导师姓名：高学云
授予年度：2022年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：胶质瘤是目前已知发病率最高的原发性颅内肿瘤,是组织学和基因上高度异质性的肿瘤。这种极高的异质性伴随着复杂的分子遗传学信息的改变,会导致肿瘤增殖能力、侵袭能力和药物敏感性的不同,最终会影响对肿瘤患者的疾病诊断与预后判断。经典组织病理学对脑胶质瘤疾病的分型往往忽视肿瘤的高度异质性,难以对患者实现精准的诊断治疗及临床预后。2016年世界卫生组织在组织病理学的框架内加入了分子诊断的补充,将胶质瘤分成不同病理级别的亚型,基于基因表型的脑胶质瘤分型可以更加客观合理地指导病人的个体化诊疗。从单细胞水平实现对基因及突变位点的原位成像及精准定量,是脑胶质瘤细胞精准分型、临床诊断、预后判断以及研究病理机制的最有力的工具。本论文通过构建挂锁式探针耦合原位编码反应的策略,对脑胶质瘤细胞多个RNA突变及RNA相关标志物进行原位成像,实现单细胞及组织水平的脑胶质瘤不同病理级别的可视化分型,为研究脑胶质瘤细胞异质性和病理诊断及预后提供了分析新方法。具体内容和研究结果如下:***突变检测需要依赖方法对RNA序列的高碱基分辨率识别。通过构建模块化挂锁探针并耦合原位滚环扩增反应,在单细胞水平实现对单碱基突变位点的原位及单分子分辨率的检测。根据连接酶发生连接反应需要5’连接位点互补配对的原则,借助挂锁式探针的可设计性,将挂锁式探针的5’末端设计为突变位点的互补碱基。当突变位点存在时,锁环探针可被连接酶环化并触发下游扩增反应,使得探针可特异性识别单碱基突变位点。通过对挂锁式探针不同模块序列进行优化,降低序列的二级结构、空间位阻和潜在结合蛋白对序列杂交的影响,提高对靶标的识别效率和准确性。通过一系列实验验证了构建探针进行滚环扩增反应的可行性和对RNA突变的靶向准确性。2.多靶标检测可提高分子诊断的准确性。针对目前原位成像面临的检测通量低的挑战,构建了荧光编码策略,实现了同时对多个脑胶质瘤分子标志物基因进行单分子水平的检测和定量统计。利用核酸序列的可设计性,对挂锁式探针设计两个核酸模块,耦合四种荧光标记基团,实现了八种分子标志物的同时标记。该策略可在单分子水平分析IDH1、ATRX和TERT基因突变状态联合染色体1p/19q的缺失状态并进行定量。通过荧光共聚焦成像及图像解码分析,验证了荧光编码策略的可行性和多靶标检测的准确性。3.实现了单细胞水平及组织水平的不同病理级别的胶质瘤细胞可视化分型。本研究根据8种特异目标基因的不同表达模式,来表征脑胶质瘤细胞的特定类型:以基因IDH突变、TERT突变、ATRX野生以及1p和19q的共缺失表征少突胶质瘤细胞;以基因IDH突变、1p和19q的完整表达伴随TERT突变或者ATRX突变表征星形胶质瘤细胞;以基因IDH不发生突变、1p和19q的完整表达伴随ATRX突变或者TERT突变表征原发性胶质母瘤细胞。首先利用所构建的方法对混养细胞中的胶质瘤细胞进行了分子标志物的检测分析,实现了细胞水平对脑胶质瘤细胞的准确区分。通过对脑组织切片样品前处理后,利用原位滚环扩增技术实现了不同病理级别的脑组织中胶质瘤细胞的分子标志物的原位成像,构建了脑组织中胶质瘤细胞状态和位置的可视化分型方法,为脑胶质瘤病理研究及预后判断提供了分析新工具。
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