紫苏叶超微粉的制备表征及对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用

作     者：常笑寒 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李艳华

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：紫苏叶 超微粉 溃疡性结肠炎 抗炎活性 

摘      要：肠炎是兽医临床常见的疾病,严重影响了畜禽的生长,降低养殖户的收益。其中,溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)具有慢性、易复发和难以根治等特点。现阶段UC的治疗,仍以抗炎为主,常用抗生素、氨基水杨酸类、糖皮质激素类以及免疫抑制剂等药物,但是这些药物临床上治疗效果不理想,且存在严重的不良反应,因此找到一种更为合理且有效的替代疗法迫在眉睫。中兽药治疗肠炎的历史悠久,极具开发价值。紫苏在我国具有长期的临床应用历史,是国家卫生部首批公布的药食同源中药之一,中医理论认为紫苏叶具备解表散寒、行气和胃等多种功效。本研究应用超微粉碎技术制备紫苏叶超微粉,确定最佳制备工艺并对紫苏叶超微粉进行表征以及体外溶出度评价;通过体外抗氧化以及抗炎活性试验,证明了紫苏叶超微粉的抗氧化和抗炎作用;并在此基础上,建立了小鼠溃疡性结肠炎模型,评估了紫苏叶超微粉对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用,最后应用超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术明确紫苏叶超微粉的药效物质基础,具体研究结果如下:(1)通过单因素试验与主成分分析法结合,优化了紫苏叶超微粉的制备工艺,最佳制备工艺为:粗粉过筛目数80目、进样体积20 g、粉碎时间90 s。并且在此制备工艺下紫苏叶超微粉中有效成分含量最高,迷迭香酸含量为7.45±0.07 mg/g、总酚含量为14.33±0.57 mg/g、总黄酮含量为11.60±0.48 mg/g,最佳超微粉物理特性参数分别为:堆积密度为0.20±0.01 g/m L、振实密度为0.42±0.01 g/m L、压缩度为57.56±0.97%、休止角为46.78±0.06°、滑动角为46.78±0.06°、持水力为2.59±0.04 g/g、持油力为1.62±0.01 g/g、膨胀力为1.81±0.04 m L/g、润湿下沉时间为49.66±1.17 s。(2)通过ABTS+·自由基清除试验评估紫苏叶超微粉的体外抗氧化活性,结果表明,其IC为5.67 mg/m L,在20 mg/m L时,清除率为91.99±1.37%;通过CCK8法测定紫苏叶超微粉对RAW264.7细胞活力的影响,结果表明在8 mg/m L浓度以下,细胞存活率均高达90%以上,说明其无细胞毒性;利用LPS诱导RAW264.7建立炎症细胞模型,结果表明紫苏叶超微粉可以显著降低细胞上清液中NO、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)以及白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的含量(p0.01),说明紫苏叶超微粉具有较好的体外抗炎活性。(3)运用光学显微镜和扫描电子显微镜对紫苏叶超微粉进行表征,结果表明,经过超微粉碎后紫苏叶细胞破壁率和粉体均匀度明显提高;利用红外光谱分析超微粉碎前后的化学结构变化,结果表明红外光谱图的出峰位置基本无差别,即没有新物质产生。(4)通过桨法评估紫苏叶超微粉在不同溶出介质中的溶出度,结果表明,紫苏叶超微粉在人工胃液中20 min时,总酚最高溶出率为98.34±1.79%,30 min时,总黄酮最高溶出率为98.07±1.91%;紫苏叶超微粉在人工肠液中20 min时,总酚以及总黄酮均可以达到最高溶出率,分别为98.38±1.63%、98.51±1.13%。且与紫苏叶粗粉相比,紫苏叶超微粉在不同溶出介质中的有效成分溶出率均优于紫苏叶粗粉。(5)通过建立小鼠溃疡性结肠炎模型评估紫苏叶超微粉对溃疡性结肠炎治疗作用,结果表明紫苏叶超微粉可以明显改善溃疡性结肠炎小鼠的临床症状,减缓小鼠体重的下降趋势,降低疾病活动指数(DAI)评分,结肠缩短程度以及脾脏指数。降低了小鼠白细胞(White blood cell,WBC)水平,提高了红细胞(Red blood cell,RBC),血红蛋白(Hemoglobin,HGB)以及血小板(Blood platelet,PLT)水平。不仅如此,紫苏叶超微粉还可以明显改善小鼠结肠黏膜组织形态,缓解组织溃疡和水肿,显著降低小鼠结肠组织中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)活性,提高超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性(p0.01),显著降低了结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量以及TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA表达量(p0.01),显著提高了小鼠结肠组织中闭锁蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的蛋白含量(p0.05),说明紫苏叶超微粉可以通过抗炎、抗氧化以及增强肠道屏障等作用缓解溃疡性结肠炎。(6)采用UPLC-Q-TOF-MS技术对紫苏叶超微粉入血成分进行检测并整合分析,最终确定8种有效成分:甘草次酸、α-亚麻酸、秦皮乙素、积雪草酸、人参环氧炔醇、亚麻酸乙酯、灵赤酸A以及姜酮,表明紫苏叶超微粉发挥药效是多种成分共同作用的结果。综上所述,本研究成功制备了紫苏叶超微粉并完成工艺优化和表征,评估了紫苏叶超微粉体外抗炎抗氧化活性,阐明了紫苏叶超微粉对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用,明确了紫苏叶超微粉的药效物质基础。本研究为紫苏叶的临床应用提供了新思路,为其功能性产品的开发提供了理论依据。