吡咯烷二硫代甲酸铵通过抑制Toll样受体4/核因子κB信号通路改善脂多糖诱导的脓毒症大鼠心肌纤维化

作     者：许哲敏 

作者单位：新疆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：彭鹏

授予年度：2023年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：脓毒症 心肌纤维化 心肌成纤维细胞 Toll样受体4/核因子κB信号通路 

摘      要：目的:探讨脓毒症大鼠心肌纤维化和Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的关系及吡咯烷二硫代甲酸铵(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对脂多糖刺激的大鼠心肌纤维化的干预作用。方法动物实验随即将30只大鼠分组,具体分组为Control组6只,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)组12只,PDTC+LPS组12只。腹腔内注射LPS二十四小时后解剖后,对大鼠的主动脉采5毫升动脉血离心后采用免疫酶联免疫吸附法(ELISA)检测离心上清中炎症因子还有肌钙蛋白的水平。HE染色后在光镜对心肌的切片进行观察;IHC检测各组心肌组织中NF-κB p65蛋白的表达水平还有磷酸化后表达位置的情况;采用Masson染色对胶原纤维在大鼠心肌的沉积情况进行观察。蛋白质免疫印迹(Western blotting)对于大鼠心脏组织中的炎症因子、NF-κB p65还有其在磷酸化后细胞核内的表达水平进行检测。细胞实验将大鼠原代心肌成纤维细胞复苏后,等待细胞贴壁生长至镜下视野内贴壁细胞大于90%后,按1∶3的比例传代培养。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测第3代细胞在不同浓度脂多糖和PDTC干预下的细胞增殖活性。经过多代培养,去第三代细胞分为三组:Control组、LPS组、PDTC+LPS组。采用蛋白质印迹法检测大鼠心肌成纤维细胞中TLR4、NF-κB-p65和磷酸化NF-κB-p65(pNF-κB-p65)、转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)蛋白表达水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Ⅰ型胶原和TGF-β1的基因的相对表达量。结果跟Control组的结果相比较,LPS组结果中的WB显示大鼠心肌组织中NF-κB p65的活化显著增加,(p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.34±0.15比1.00±0.00,P0.05)、炎症因子白细胞介素(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)的蛋白表达增加,均一化后[IL-6:1.42±0.15比1.14±0.07,TNF-α:1.23±0.10比1.00±0.04,均P0.05]。免疫组化的结果显示:在大鼠心肌细胞核中,NF-κB p65的阳性表达明显增加。HE的结果显示:LPS组的心肌组织出现间质水肿、炎性细胞的不同程度的浸润,还有心肌组织中肌纤维的断裂等。ELISA的结果显示:血清中IL-6、TNF-α、c Tn I的水平明显增加,IL-6(Pg/ml):16.66±5.28比4.52±1.80、TNF-α(Pg/ml):20.16±3.88比7.13±0.83、c Tn I(Pg/ml):79.01±17.25比54.92±16.08,均P0.05。与LPS组相比,PDTC+LPS组:(1)WB:心肌组织中NF-κB p65磷酸化水平降低,(p-NF-κB p65/NF-κB p65比值:1.34±0.15比0.92±0.07,P0.05);IL-6、TNF-α的蛋白表达减少(IL-6/GAPDH):1.42±0.15比1.14±0.07,(TNF-α/GAPDH):1.23±0.10比1.00±0.04,均P0.05。(2)IHC:心肌细胞核上NF-κB p65阳性表达明显减少。(3)HE:心肌组织的水肿、出血、炎性细胞浸润及心肌纤维断裂改善。(4)ELISA:血清中IL-6、TNF-α、c Tn I的水平明显减低,IL-6(Pg/ml):16.66±5.28比12.07±3.50、TNF-α(Pg/ml):20.16±3.88比10.82±2.05、c Tn I(Pg/ml):79.01±17.25比54.92±16.08,均P0.05。以脂多糖浓度为0μg/ml的对照组细胞增殖活力为1,其他不同浓度脂多糖组的细胞增值活力均高于对照组(均P0.001)。在含有1μg/ml脂多糖的完全培养基为基础上,使用不同浓度的PDTC干预24小时后,结果表明1μmol/L浓度PDTC组细胞的增殖活力明显降低,低于LPS组(P0.001)。与对照组相比,脂多糖组IL-6和TNF-α蛋白表达水平均显著升高(2.015±0.365)比(1.000±0.000)、(1.961±0.380)比(1.000±0.000)(均P0.05),与LPS组相比,PDTC组IL-6和TNF-α蛋白表达水平(1.052±0.186)、(0.717±0.401)明显降低(均P0.05)。与对照组相比,LPS组TLR4/NF-κB信号通路TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB-p65/NF-κB-p65比例均明显升高(1.514±0.063)比(1.000±0.000)、(1.961±0.380)比(1.000±0.000)(均P0.05)。与LPS组相比,PDTC组TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB-p65/NF-κB-p65比例(0.882±0.240)、(0.717±0.401)均明显降低(均P0.05)。与对照组相比,LPS组TGF-β1蛋白和m RNA表达水平及Ⅰ型胶原m RNA表达水平均明显升高(均P0.05)。与LPS组相比,PDTC组蛋白和m RNA表达水平及Ⅰ型胶原m RNA表达水平均明显降低(均P0.05)。结论PDTC可抑制TLR4/NF-κB信号通路,降低脂多糖刺激的大鼠心肌成纤维细胞的增殖以及炎症介质和纤维化标志物的表达,进而抑制纤维化进程。