基于锰修饰纳米酶佐剂的流感病毒黏膜疫苗研制

作     者：毕文慧 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦涛;闫喜军

授予年度：2023年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：灭活流感病毒疫苗 鼻腔黏膜免疫 佐剂 树突状细胞 纳米酶 

摘      要：流感是由流感病毒引起的一种具有高度传染性的疾病,给人类和动物的生命健康带来严重的威胁。鼻腔是流感病毒入侵机体的主要门户,黏膜免疫可以及时有效地阻断病毒的入侵与散播。但由于黏膜屏障的存在,全病毒灭活(Whole inactivated virus,WIV)疫苗经鼻腔免疫效果往往不理想,因此需开发一种新型黏膜免疫佐剂联合全病毒灭活疫苗,提高鼻腔黏膜免疫效果。前期研究发现氧化铁纳米酶(Iron oxide nanozyme,IONzyme)具有黏膜佐剂特性,但效果仍需提高。由于其具有可修饰性,本研究通过将能够调控多种酶的活性且具有免疫特性的锰(Manganese,Mn)和带有正电荷且安全性和稳定性良好的支化聚乙烯亚胺(Polyethylenimine branched,PEI)偶联到IONzyme表面,从而设计一种新型黏膜免疫佐剂(Mn-PEI-IONzyme),并对其安全性和免疫效力进行评价。1、锰修饰氧化铁纳米酶的制备与表征采用水热合成法制备Mn-PEI-IONzyme,对合成参数进行优化,对合成产物进行表征分析和安全性评价。首先对PEI的分子量以及Mn和PEI的修饰剂量进行筛选,通过透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察形态和通过测定类过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性最终筛选PEI的分子量为25 kDa,修饰量为0.1 g,Mn的修饰量为0.5 g。通过TEM和扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察,发现Mn-PEI-IONzyme形态规则,粒径约为160 nm,呈圆球状;通过能量色散谱(Energy dispersive spectroscopy,EDS)、X 射线衍射(X-ray diffraction,XRD)和 X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)分析表明Mn和PEI成功偶联到IONzyme上;通过类POD测定,发现Mn-PEI-IONzyme的类POD活性最高;通过Zeta电势的测定发现IONzyme带负电荷,Mn-PEI-IONzyme带正电荷;小鼠安全性评价所示,与空白对照组相比,滴鼻Mn-PEI-IONzyme对小鼠体重变化并无影响,小鼠的脏器组织并未出现病变,且血液生化指标及血液学指标均无显著差异性,表明Mn-PEI-IONzyme具有良好的生物相容性。2、Mn-PEI-IONzyme对树突状细胞活化和成熟的影响为了探讨Mn-PEI-IONzyme对树突状细胞(Dendritic cells,DCs)活化和成熟的影响,将Mn-PEI-IONzyme与小鼠骨髓源DCs共同培养24 h后,收集DCs及其上清液,检测DCs表型、活化和迁移标志、细胞因子的分泌、刺激CD4+T细胞增殖、吞噬能力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。与对照组相比,Mn-PEI-IONzyme显著增强DCs表型标志MHCII、CD40、CD80和CD86的表达,以及活化标志CD69和迁移标志CCR7的表达;同时促进细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12p70、IL-6和IL-10的分泌;在混合淋巴细胞反应试验中,Mn-PEI-IONzyme组DCs显著刺激CD4+T细胞的增殖;Mn-PEI-IONzyme刺激后的DCs吞噬FITC-Dextran的能力显著下降。通过透射电镜观察发现Mn-PEI-IONzyme存在于DCs的溶酶体中。对ROS水平进行检测,发现Mn-PEI-IONzyme促进DCs胞内ROS的产生;然而,使用ROS抑制剂后,ROS的产生显著下降,DCs表型标志CD40和MHCII的表达显著下降。上述结果表明,Mn-PEI-IONzyme通过ROS途径诱导DCs的活化和成熟。3、基于Mn-PEI-IONzyme佐剂的流感鼻腔黏膜递送疫苗的免疫效力评价小鼠鼻腔免疫H1N1 WIV+Mn-PEI-IONzyme疫苗28天后测定其免疫效力。与单独H1N1 WIV组相比,Mn-PEI-IONzyme佐剂组的鼻腔、气管和肺脏涮洗液中IgA、血清中 IgG 其亚型(IgG1 和 IgG2a/c)以及血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)抗体水平均显著提升,小鼠脾脏中CD3+CD4+T细胞亚群的比例显著增加。小鼠免疫28天后,以106 EID50/50 μL鼻腔接种H1N1流感病毒,对小鼠的体重变化、存活率、肺脏病变及载毒量进行检测。结果显示,单独H1N1 WIV组小鼠体重急剧下降,小鼠存活率为40%,Mn-PEI-IONzyme佐剂组小鼠体重下降缓慢且很快恢复,小鼠存活率为100%。与单独H1N1