膜融合微球及界面的构建及其对细胞外囊泡中microRNA超灵敏检测应用研究

作     者：冯健洲 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡效亚;徐林

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：肿瘤诊断 液体活检 细胞外囊泡 小分子核糖核酸 膜融合 

摘      要：细胞外囊泡是细胞释放的一种小型囊泡,携带着许多的生物标志物。其中,miRNA对癌症早期诊断和治疗监测具有重要作用。然而,直接裂解细胞外囊泡提取miRNA存在降解和污染的问题。为解决这一问题,膜融合技术被广泛应用。该技术通过将自制的脂质体囊泡与细胞外囊泡融合,实现miRNA的检测。膜融合方法简单、快速、高效,避免了 miRNA直接暴露于体液中,提高了检测准确性。在这种方法中,脂质体囊泡作为载体,并携带信号报告分子,如荧光染料或电化学标记物。在与细胞外囊泡发生融合后,发出信号,用于miRNA的检测。膜融合技术具有广泛的应用前景,可用于癌症早期诊断、预测疾病进展和指导治疗方案等。它为非侵入性的细胞外囊泡miRNA检测提供了一种可行的方法,为临床诊断提供了有力支持。然而,目前的利用膜融合的方法仍然存在以下弊端:1、由于缺少特异性靶向分子,体液中存在的大量正常细胞分泌的细胞外囊泡会增加信号的背景噪音,降低的检测的准确率。2、无法同时对多种miRNA进行检测,导致对癌症的检测准确率下降。针对上述问题,本文设计并组装一种膜融合微球。一方面,通过在微球表面修饰靶向肿瘤细胞的识别分子,实现对肿瘤细胞来源的细胞外囊泡中的miRNA的检测,降低了信号的背景。另一方面,通过尺寸和荧光双编码微球,实现对多种miRNA同时检测,大大提高诊断的准确率。具体工作如下:(1)采用自组装的方式将分子信标负载到介孔硅的介孔内,并在表面形成一层支持的脂质双层。利用疏水作用,在脂质双层上修饰针对肿瘤来源的细胞外囊泡的识别分子,实现了对肿瘤来源的细胞外囊泡的靶向捕获,在捕获肿瘤来源的细胞外囊泡,细胞外囊泡上的磷脂双分子层和微球上的磷脂双层发生膜融合,miRNA和分子信标杂交发出信号。以A375细胞系的细胞外囊泡作为模型,此融合微球的有优异的miRNA的检测性能,检测限达到14fM,同时在对临床样本的检测上,能够成功区分胰腺癌患者和健康人。(2)通过将两种荧光分子按照不同比例修饰到不同尺寸的微球上,制备了一个荧光和尺寸双编码的微球库。将针对不同miRNA的分子信标分别负载到微球后,结合第一章的工作,修饰支持的脂质双层和适配体。再和检测细胞外囊泡中的miRNA后,通过流式细胞仪进行解码和信号读出,实现对6种miRNA 同时检测。随后应用到临床样本,我们选取了 10个健康人,6个胰腺炎患者和20个胰腺癌患者的血浆,利用此方法检测,对胰腺癌患者的诊断准确率达到98%,展现较好的临床应用潜力。(3)我们综合前两章的研究成果,将融合微球的经验与鱼骨状微流控芯片相结合,构建了一种融合芯片。相较于超速离心等传统分离方法,此融合芯片显著提高了对肿瘤来源细胞外囊泡的捕获效率,达到了 77%的高分离效率,同时,其对非肿瘤来源的细胞外囊泡只有17%的非特异性捕获。同时,我们还成功验证了该芯片可用于检测细胞外囊泡中的miRNA-21。此外,该融合芯片对样本需求更小,显示出其在癌症早期诊断方面的潜力。