基于表面增强拉曼光谱的NGAL蛋白定量方法研究

作     者：房桂林 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡林君

授予年度：2023年

学科分类：081704[工学-应用化学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 10[医学] 

主      题：NGAL 核酸适配体 表面增强拉曼光谱 生物标志物 

摘      要：中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)是一种分泌性糖蛋白,能稳定存在于血清、血浆、尿液等体液样本中。体液中NGAL水平与急性肾损伤、急性感染、肿瘤等疾病具有相关性。目前,NGAL用作急性肾损伤早期诊断标志物已被广泛报道。定量方法对生物标志物的实验室研究和临床应用至关重要。建立灵敏度高、特异性强、动态范围宽、重复性和可靠性好、操作简单、检测通量高且可自动化的生物标志物检测方法,一直是人们努力的方向。至今,已有蛋白印迹(Western-blotting,WB)、放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、化学发光免疫分析技术(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)、颗粒增强比浊免疫分析技术(Particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)等免疫定量方法及相应仪器用于NGAL定量,极大促进了NGAL的基础研究和临床应用。由于NGAL在体液中的浓度变化范围宽(低至ng/m L,而高达几十mg/m L),拓展NGAL定量方法的线性检测范围一直是该领域的重点之一。此外,NGAL用作急性肾损伤标志物时,检测耗时对其临床应用价值具有重要影响。因此,研发NGAL的床旁检测技术(Point-of-care testing,POCT)是该领域的另一热点。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)具有快速、灵敏度高、样品用量少及无损检测等优点,其在生物分子检测方面的应用越来越受到人们的重视。基于NGAL定量需求及课题组前期研究基础,本论文尝试建立基于SERS的NGAL蛋白新型定量方法,主要研究内容和结果如下:(1)建立基于SERS的NGAL蛋白的固相定量方法。首先,通过对硅片依次进行羟基化、烷基化及醛基化等修饰实现NGAL抗体与硅片的共价偶联,制成NGAL检测芯片。同时,以4-硝基苯硫酚(4-Nitrothiophenol,4-NTB)为拉曼报告分子、Ag@Au核壳结构纳米颗粒为拉曼增强基底、NGAL核酸适配体为特异性识别分子,制备了NGAL的SERS检测探针Ag-NTB@Au-apt。随后,通过对检测体系初步优化,建立NGAL的SERS固相定量方法。方法学研究结果显示:线性检测范围为0.1～1000 ng/m L(最低检测限为0.054 ng/m L)、回收率为86.84%、批内和批间差异分别为19.34%和33.06%。这表明该方法线性检测范围较宽且检测灵敏度高。另一方面,该方法存在检测耗时长(超过2 h)、批内与批间变异系数较大等不足。可见,该方法虽然具有检测范围宽和灵敏度高等显著优势,但仍需进一步优化以缩短检测耗时和提高重复性。(2)建立基于SERS的NGAL蛋白的液相定量方法。首先,本论文制备了偶联NGAL核酸适配体的金纳米颗粒(Au NPs)以及银纳米颗粒(Ag NPs)。其中NGAL蛋白与拉曼报告分子孔雀石绿(Malachite Green,MG)能竞争性结合Au NPs上的核酸适配体;Au NPs和Ag NPs用作MG的SERS基底,以MG的拉曼强度为参数实现对NGAL的定量。接着,通过对样品孵育时间、MG浓度、离心条件、纳米颗粒封闭等条件的初步优化建立基于SERS的NGAL的液相定量方法。方法学研究结果显示:线性检测范围为0.15～5 pg/m L(最低检测限为0.133 pg/m L)、回收率为87.513%、检测耗时约1.5 h、批内和批间差异分别为12.10%和31.03%。这些数据表明该方法能显著提高检测灵敏度、缩短检测耗时,但其检测线性范围窄、批间差异大。因此,该方法仍有很大改进空间。综上,本论文建立了两种基于表面增强拉曼光谱的NGAL蛋白特异性定量方法。这些方法的建立和完善将丰富NGAL定量方法,有助于NGAL的实验室研究和临床应用。此外,本论文研究为SERS技术在生物标志物检测方面的应用提供实验参考和理论依据。