人参皂苷Rb1通过线粒体自噬缓解3-氯-1,2-丙二醇诱导的肾细胞焦亡

作     者：张冉冉 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：关爽

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：人参皂苷Rb1 3-氯-1,2-丙二醇 焦亡 线粒体自噬 转录因子EB 

摘      要：细胞焦亡是由炎症小体引起的程序性死亡形式,与多种疾病密切相关。3-氯-1,2-丙二醇(3-chloro-1,2-propanediol,3-MCPD)是一种受热引起的食品加工污染物,其靶器官是肾脏和男性生殖器官。已经有研究证实3-MCPD可以激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症体,并在体内和体外诱导肾细胞焦亡。人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,Gs-Rb1)具有抗氧化、抗炎、免疫调节和神经保护等多种药理功能。线粒体是真核细胞中用于能量产生和代谢的重要细胞器,线粒体受损会导致线粒体功能障碍,线粒体活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)积累。受损或功能失调的线粒体可被线粒体自噬降解,以维持细胞内稳态。转录因子EB(Transcription factor EB,TFEB)在调控溶酶体生物合成和自噬转录方面具有关键作用。此前,我们发现Gs-Rb1可以通过刺激自噬通量来改善3-MCPD诱导的肝脏损伤,这表明Gs-Rb1可能是一种潜在的可以对抗3-MCPD毒性的天然化合物。然而,Gs-Rb1对3-MCPD诱导的细胞焦亡的保护作用及其具体的调节机制仍不清楚。因此,进一步研究Gs-Rb1能否改善3-MCPD诱导的肾细胞焦亡及其作用靶点对3-MCPD诱导的肾损伤的预防和缓解具有一定意义,同时提供了一定的理论基础。本研究利用3-MCPD在ICR小鼠和NRK-52E细胞中构建了细胞焦亡模型,探究了Gs-Rb1对3-MCPD诱导的细胞焦亡的保护作用,并深入阐明Gs-Rb1改善3-MCPD诱导的焦亡的具体机制。主要研究内容与结果如下:(1)Gs-Rb1通过激活线粒体自噬缓解3-MCPD诱导的ICR小鼠肾细胞焦亡。通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,H&E)染色、肌酸(urine albumin creatine,UA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,CRE)含量检测以及小鼠肾重比,确定Gs-Rb1能够缓解3-MCPD诱导的小鼠肾脏损伤;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清以及细胞培养上清液中炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的释放,结果显示Gs-Rb1可以显著降低3-MCPD诱导的IL-1β和IL-18的释放;小鼠血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量检测结果同样显示Gs-Rb1可以显著降低3-MCPD诱导的LDH释放;小鼠肾脏组织中焦亡相关蛋白利用Western blot检测,确定Gs-Rb1能够显著抑制3-MCPD诱导的NLRP3活化,显著下调消皮素D蛋白N端(gasdermin D-N,GSDMD-N)和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Cleaved caspase-1)蛋白表达水平;采用荧光探针DCFH-DA对ICR小鼠肾细胞内ROS的生成情况进行检测,结果显示Gs-Rb1可以显著抑制3-MCPD诱导的ROS积累;通过检测线粒体自噬相关蛋白:微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)、P62(sequestosome 1,SQSTM1/P62)、PTEN诱导的正蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和E3泛素连接酶(Parkinson disease protein 2,Parkin)表达水平,结果表明Gs-Rb1显著上调LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达,显著下调P62蛋白表达;而自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)的使用会逆转这些趋势,并上调NLRP3、GSDMD-N和Cleaved caspase-1蛋白表达水平;利用组织免疫荧光染色检测PINK1和LC3的共定位情况,结果表明GsRb1显著促进了PINK1和LC3的共定位,然而CQ的加入会抑制Gs-Rb1促进PINK1和LC3共定位的效果。以上实验结果证明Gs-Rb1可以通过激活线粒体自噬缓解3-MCPD诱导的ICR小鼠肾脏细胞焦亡。(2)Gs-Rb1通过促进线粒体自噬缓解3-MCPD诱导的NRK-52E细胞焦亡。通过噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、LDH实验,确定Gs-Rb1的无毒剂量并选择出合适的浓度用于后续实验,确定Gs-Rb1能够改善3-MCPD诱导的NRK-52E细胞死亡;ELISA检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放,表明Gs-Rb1在NRK-52E细胞内抑制3-MCPD诱导的IL-1β和IL-18的释放;检测GsRb1对细胞内焦亡蛋白表达的影响,结果显示Gs-Rb1在体外显著抑制NLRP3、GSDMD-N和Cleaved caspase-1蛋白表达;检测Gs-Rb1对细胞内线粒体自噬蛋白表达的影响,同样发现Gs-Rb1在体外显著上调LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达,下调P62蛋白表达,而加入线粒体自噬抑制剂环孢素菌素A(Cyclosporin A,Cs A)同样在体外扭转了这一现象;细胞免疫荧光染色检测NRK-52E细胞内PINK1和LC3的共定位情况,结果发现Gs-Rb1显著提高了PINK1和LC3的共定位,然而Cs A的加入降低了PINK1和LC3的共定位;利用荧光探针DCFHDA检测细胞内ROS释放水平,JC-1探针检测细胞内线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP),结果同样显示Cs A预处理会逆转Gs-Rb1抑制ROS积累和MMP下降的作用。这些结果表明Gs-Rb1可以通过促进线粒体自噬抑制3-MCPD导致的NRK-52E细胞焦亡。(3)Gs-Rb1通过TFEB信号通路促进线粒体自噬缓解3-MCPD诱导的NRK-52E细胞焦亡。研究发现Gs-Rb1剂量依赖式增加小鼠肾脏及NRK-52E细胞TFEB表达,促进细胞核TFEB蛋白表达,降低细胞质TFEB蛋白表达,表明TFEB可能参与调控Gs-Rb1缓解的3-MCPD诱导的焦亡。进一步通过小干扰TFEB(siTFEB)处理NRK-52E细胞,检测线粒体自噬相关蛋白LC3、P62、PINK1、Parkin的表达水平,以及焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD-N、Cleaved caspase-1的表达水平,结果表明预处理敲低TFEB的NRK-52E细胞,PINK1、Parkin蛋白表达水平降低,其余蛋白表达水平均升高;同样,Mito-Tracker Red和LC3共定位结果也显示Gs-Rb1促进Mito-Tracker Red和LC3共定位,而si-TFEB逆转这种现象。以上结果表明Gs-Rb1通过TFEB信号通路激活线粒体自噬从而改善3-MCPD诱导的NRK-52E细胞焦亡。