极化巨噬细胞的免疫微球工程化的水凝胶人工黏膜促进口腔黏膜再生
作者单位：苏州大学
学位级别：硕士
导师姓名：葛自力
授予年度：2022年
学科分类：08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学]
摘 要：目的:制备免疫微球工程化的水凝胶人工黏膜,并表征其理化特性、生物相容性、免疫调控能力,研究其促血管生成能力及口腔黏膜再生的能力。方法:首先通过微流控技术制备负载IL-4的磷脂(SL)复合物和构建装载SL/IL-4的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微流控微球,之后均匀分散在GelMA水凝胶溶液中后光交联,得到极化巨噬细胞(BMMs)的免疫微球工程化的水凝胶人工黏膜。最后通过原子力学显微镜(AFM)、红外光谱分析(FTIR)、X线能谱分析仪(EDS)、水接触角仪(WCA)、扫描电镜(SEM)、ELISA等方法进行材料的形貌、理化性能表征。将大鼠成纤维细胞种植在水凝胶人工黏膜上,以CCK-8法和细胞荧光染色,通过评估细胞增殖情况以考察水凝胶的细胞相容性。将水凝胶与巨噬细胞共培养7天后,通过流式细胞技术、qRT-PCR、EILSA检测以及细胞免疫荧光染色检测极化后的巨噬细胞表型、促炎基因TNF-α、抗炎基因TGF-β的表达及细胞因子PDGF、VEGF的分泌情况,综合评估水凝胶人工黏膜的调控功能。用极化后的上清液培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),考察水凝胶成血管的能力。最后建立兔口腔黏膜缺损模型,评价水凝胶人工黏膜促进黏膜再生效果。结果:通过SEM、AFM、EDS检测装载IL-4磷脂复合物(SL/IL-4)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球和水凝胶人工黏膜表面形貌和内部结构,证明磷脂IL-4复合物成功的引入了 GelMA水凝胶,并且没有破坏GelMA水凝胶内部的三维立体结构。之后经过FTIR和Elisa试剂盒的检测更进一步证实成功构建了免疫微球工程化的水凝胶人工黏膜,而且一定程度上提高了 IL-4的负载率。同时孔隙率、降解速率、释放速率、水接触角结果进一步表明该人工黏膜的材料性能得到不同程度改进,发现引入磷脂后的微球表面孔径减小,微球直径大小无明显变化,能够保护并缓释IL-4,使得免疫微球工程化水凝胶中IL-4包封率相比于纯PLGA微球增加,释放速率平缓,该结果为之后进一步的体外及体内研究提供了实验基础。细胞活死染色和CCK8结果显示成纤维细胞在水凝胶膜上生长状态良好,表明水凝胶人工黏膜对细胞的增殖没有明显的影响。α-SMA荧光染色表明复合纤维支架对细胞具有良好的黏附性能。极化BMMs流式结果显示实验组CD11b/CD206阳性细胞较空白对照组有显著增多,且与突释组无明显差异。RT-PCR结果显示实验组有效的使得促炎基因TNF-α表达量随时间逐渐下降,同时抑炎基因TGF-β表达量呈上升趋势,并与对照组具有显著性差异(P0.05)。ELISA和免疫荧光染色结果与三组BMMs基因表达类似,进一步提示极化巨噬细胞的免疫微球工程化的水凝胶人工黏膜,缓慢释放IL-4以极化BMMs极化方向,从而精准抑制炎症因子,促进抑炎因子及PDGF的分泌。HUVECs在水凝胶极化BMMs作用后的上清液培养5小时,可以分化排列成明显的网状结构。兔口腔模型缺损修复HE、MASSON切片结果提示空白对照组(blank control)、阴性对照组(GelMA/PLGA/SL)以及突释对照组(GelMA/IL-4)黏膜厚度较薄,钉突数量少,且与实验组(MSaP-aL/p)具有显著性统计学差异(P0.05)。免疫组化CD34提示实验组创面血管生成数量最多。同时显示组织内CD206表达明显高于其余三组,同时CD86的表达低于其余三组。进一步的提示IL-4在体内可以通过极化巨噬细胞,诱导M2极化,从而调节创面微环境,促进组织快速愈合。结论:顺利构建免疫微球工程化的水凝胶人工黏膜,并且该人工黏膜具有良好的溶胀性能、亲水性和药物控释功能。具有良好生物相容性,可促进细胞黏附、增殖;并且能够极化M2型巨噬细胞分泌抑炎因子和PDGF促进血管内皮细胞生成。在兔口腔黏膜缺损处进行免疫调控,能够有效降低局部炎症反应为黏膜再生创造理想微环境,同时促进血管,并且在显著减少后期瘢痕组织形成。
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