甘草次酸衍生物配体介导脂质体的靶向性及脂质体X的稳定性研究

作     者：金粟 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王秀丽

授予年度：2017年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：甘草次酸衍生物 丹参脂质体 肝靶向性 离心分光光度法 稳定系数 聚丙烯酰胺 主动肝靶向 

摘      要：目的1.肝脏的实质细胞表面存在大量甘草次酸受体,本研究依据这一原理,拟合成两种以甘草次酸为母核的肝实质细胞主动靶向配体甘氨酸丁二酸甘草次酸十八烷酯(18-GA-Gly)和丙氨酸丁二酸甘草次酸十八烷酯(18-GA-Ala),以中药丹参的有效成分丹酚酸B(Sal B)和丹参酮ⅡA(TSN)为模型药物,制备两种合成配体介导的肝实质细胞主动靶向脂质体,并研究其药代动力学和组织分布情况,计算相对摄取率Re、最大峰浓度之比Ce,靶向系数Te,评价两种配体的肝靶向效果。2.课题组对制备方法及处方进行优化得到脂质体X,从物理角度和化学角度筛选可加入的稳定辅料的种类和浓度,以提升脂质体X的稳定性。方法本实验分为以下两个部分第一部分 两种甘草次酸衍生物介导肝主动靶向脂质体的制备及靶向性考察以甘草次酸为母核,通过酯化反应使其一端连接硬脂醇,另一端先通过酰化反应连接丁二酸酐,然后分别与甘氨酸、丙氨酸反应得到配体18-GA-Gly和18-GA-Ala。以Sal B和TSN为模型药,通过薄膜分散-高压乳匀法制备配体修饰的两种脂质体(Gly-TS-Lip和Ala-TS-Lip),并制备不含配体的丹酚酸B-丹参酮ⅡA脂质体(TS-Lip)作为对比,以马尔文激光粒径仪检测三种脂质体的粒径、电位,拍摄透射电镜获得粒子形态,测定包封率、载药量,按实验室前期方法进一步制备冻干脂质体,并检测其复溶后的粒径、电位、包封率和载药量。根据脂质体种类将实验小鼠分为三组,采取尾静脉注射的方式给药,获取小鼠给药后 0.083、0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6 h 的血浆样本和心、肝、脾、肺、肾组织样本,UPLC测定各样本中SalB和TSN含量,采用DAS 3.2软件按非房室模型处理数据,计算药代动力学参数,绘制组织分布柱形图并计算相对摄取率(Re)、最大峰浓度之比(Ce)、靶向效率(Te),以此来评价两种配体的肝靶向效果。第二部分 脂质体X稳定性优化的初步研究对实验室前期处方优化得到的脂质体X进行稳定性研究,分别从物理角度和化学角度评价加入稳定辅料的种类及浓度对脂质体X稳定性的影响。物理角度选择的考察方法为离心分光光度法,测定脂质体X加入稳定辅料前后的稳定系数(KE),以KE值变化情况判断稳定辅料效果优劣,考察的辅料包括单独使用的微粉硅胶、黄原胶、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇(PVA18-88)、聚丙烯酰胺(阴离子型APAM1000、非离子型NPAM1400)以及两种聚丙烯酰胺与两种微粉硅胶两两搭配使用。化学角度以TBA检测法考察维生素E加入后对脂质体X稳定性的影响。通过以上实验手段,初步判断各稳定辅料加入后对脂质体X稳定性的影响,初步确定加入浓度,以期对后期脂质体X的稳定性研究提供参考依据。结果第一部分:根据实验室前期合成基础获得两种新型肝实质细胞靶向配体18-GA-Gly和18-GA-Ala,该部分由合作课题组完成。分别建立可以同时检测SalB,TSN和两种配体的UPLC色谱方法;通过薄膜分散-高压乳匀法制得18-GA-Gly和18-GA-Ala修饰的Sal B-TSN脂质体。确定水溶性药物Sal B的加入顺序为高压均质后加入并进行30 min的孵育。测得冻干前理化性质Ala-TS-Lip、Gly-TS-Lip及TS-Lip的粒径分别为169.1 ±8.13 nm、205.6±19.51 nm、178.6±7.34nm,电位结果分别为-30.60±1.31 mV、-24.7±0.15 mV、-27.7±0.95mV,Sal B 的包封率分别为 95.33±3.79%、83.09±1.75%、82.45±1.64%,TSN 的包封率分别为 71.33±7.09%、75.49±2.23%、79.65±10.49%,两种配体的结合率分别为18-GA-Ala 93.67±8.33%,18-GA-Gly 97.95±1.85%,透射电镜结果显示三种脂质体均粒径圆整,分散均匀。以9%蔗糖水溶液为冻干保护剂制备冻干脂质体。冻干后理化性质分别为Ala-TS-Lip、Gly-TS-Lip及TS-Lip的粒径分别为201.7 ±10.45 nm、246.4±22.86nm、258.7±11.23 nm,电位结果分别为-31.40±0.25 mV、-26.7±0.40mV、-30.0±0.93mV,SalB 的包封率分别为 88.00±2.00%、86.27±1.39%、89.62±0.41%,TSN 的包封率分别为 60.00 ± 6.08%、66.66±0.59%、66.32±5.69%,两种配体的结合率分别为 18-GA-Ala 89.67±2.52%,18-GA-Gly 89.94±1.20%,。小鼠血浆及组织含量检测方法采用实验室前期建立方法,可以高效、准确的