坏死性凋亡介导的HMGB1释放在肝螺杆菌感染致肝损伤中的作用

作     者：丁世平 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张泉

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：肝螺杆菌 肝损伤 坏死性凋亡 重组腺病毒 HMGB1 

摘      要：肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus,***)是一种可感染多种啮齿类动物的病原菌,可引起某些品系小鼠肝损伤、肝炎和肝癌等疾病。坏死性凋亡是一种新发现的程序性细胞死亡,其在肝脏疾病中发挥着重要作用。研究表明,坏死性凋亡细胞通过释放包括高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)在内的损伤相关分子模式诱发肝脏炎症,进而加剧肝损伤。此外,本课题组前期研究发现,***感染可促进肝细胞HMGB1的释放,但其具体机制尚不明确。本研究旨在探究***感染诱导肝细胞释放HMGB1的机制及其在肝损伤中的作用,为进一步揭示***感染引起肝损伤的致病机理提供理论依据。1.肝螺杆菌感染诱导肝细胞坏死性凋亡对HMGB1释放的影响为揭示*** 感染诱导肝细胞释放HMGB1的机制,本研究以***感染AML12细胞,利用ELISA、RT-qPCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光等技术进行探究。结果显示,与对照组相比,***感染组Ripk1、Ripk3、Mlkl的转录水平和RIPK3、MLKL、p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL蛋白表达水平以及细胞上清中HMGB1的含量均明显升高(P0.05或P0.01),并呈剂量和时间依赖关系;细胞中的HMGB1从细胞核向细胞质中转移(P0.05或P0.01)。用MLKL抑制剂GW806742X预处理后,***感染组细胞培养上清中LDH和HMGB1的含量显著降低(P0.05),细胞核HMGB1移位至细胞质的现象减轻(P0.05),细胞内Fluo-4荧光强度降低。以上结果表明,***通过诱导肝细胞坏死性凋亡,从而促进HMGB1的移位及释放。***1基因干扰腺病毒的制备及功能鉴定为探究HMGB1在***感染致BALB/c小鼠肝损伤中的作用,设计并合成3对靶向小鼠HMGB1基因的shRNA单链寡核苷酸,退火后克隆至腺病毒穿梭载体pDC316-ZsGreen1-shRNA得到3个重组穿梭质粒。将其与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染至293A细胞,以包装重组腺病毒Ad-shHMGB1-318、Ad-shHMGB1-376、Ad-shHMGB1-772。将三种腺病毒分别或混合后感染AML12细胞筛选干扰效果最好的重组腺病毒,并在BALB/c小鼠肝脏组织中验证其干扰效率。结果显示,重组穿梭质粒经酶切验证及测序后均正确。与对照组相比,腺病毒感染组细胞中HMGB1的基因转录和蛋白表达水平均显著降低(P0.05),与此同时,将三种腺病毒混合后感染其干扰效果更好。该重组腺病毒可使小鼠肝脏的HMGB1 mRNA和蛋白表达水平分别降低65%和68%。提示,本研究制备的HMGB1干扰腺病毒能有效抑制小鼠HMGB1的表达,可用于后续实验。***1在肝螺杆菌感染致小鼠肝损伤中的作用28只雄性BALB/c小鼠随机为4组,每组7只,分别为:对照组、***感染组、Ad-shHMGB1组和Ad-shHMGB1+***组。尾静脉注射重组腺病毒干扰HMGB1的表达,2 d后,腹腔注射***,并于***注射后7 d采样。观察肝脏组织病理学变化,检测坏死性凋亡关键调控蛋白和炎性因子的表达。结果显示,***感染后,肝脏中Hmgb1、Ripk1、Ripk3、Mlkl的转录水平和HMGB1、RIPK3、MLKL、p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL 蛋白表达水平上调(P0.05 或P0.01)。免疫组化结果显示,***感染组HMGB1由细胞核转移至细胞质,MLKL在细胞质表达量增多;干扰HMGB1的表达可减轻***感染引起的肝损伤及炎性因子Il-6,Tnf-α,Il-1β和Inos的表达(P0.05)。结果表明,***感染可诱导肝细胞坏死性凋亡,释放HMGB1,干扰HMGB1的表达可减轻肝损伤。综上所述,***感染可致肝细胞坏死性凋亡,从而促进HMGB1移位及释放。干扰HMGB1的表达,可降低HMGB1释放及炎症因子的表达,进而减轻***感染引起的肝损伤。