纳豆激酶的固定化研究

作     者：王儒雅 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张应玖

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：纳豆激酶 壳聚糖 中和滴定法 固定化酶 酶学性质 β-淀粉样蛋白1-42 

摘      要：纳豆激酶具有溶栓、降血压、降血脂以及神经保护等药用价值。与传统的药物相比,纳豆激酶的底物特异性较强,并且在使用后不会出现局部出血等副作用,有望成为新型心血管疾病治疗以及神经保护药物。纳豆激酶最突出的优势在于它的安全性和具有一定的抗消化液降解的特点。虽然该优势可能不是很强,但却为纳豆激酶的治疗目的可以通过口服给药的形式达成提供了可能。为了尽量降低纳豆激酶在口服给药过程中的被降解或者失活,以提高其以完整的形式通过胃肠道而被吸收,增强纳豆激酶的治疗效果,需要提高纳豆激酶口服后的稳定性。酶的固定化处理是指使用化学或者物理的手段将酶固定在合适的载体材料上,对酶的空间结构以及活性部位进行良好的保护,在提高了酶的稳定性和重复使用性的同时,最大限度的保留了酶的高效催化能力和底物专一性。壳聚糖来源丰富、便宜易得、安全无毒,有良好的吸附能力和成膜能力,并且具有良好的生物相容性以及生物降解性,是一种公认的安全功能材料。本文以壳聚糖微球为载体,对纳豆激酶进行固定化。通过本论文的研究,取得如下主要的结果:1.本文通过中和滴定法制备壳聚糖微球,通过戊二醛将游离的纳豆激酶FA3及NK(以下分别简称为FA3、NK)通过共价结合法进行固定化处理。依据时间、温度、p H、戊二醛浓度的单因素实验结果,按照L(3)设计九组正交实验,对纳豆激酶的固定条件进行优化,正交实验的三因素分别为温度、p H、戊二醛浓度。对正交实验结果分析可得,FA3及NK的最佳固定化的条件分别为30℃,p H 6.0,1.0%(V/V)戊二醛;30℃,p H 6.0,戊二醛浓度1.5%(V/V)。使用最佳固定条件得到的固定化的纳豆激酶FA3和NK(以下分别简称为i FA3、i NK)的(表观)比活力分别是FA3、NK比活力的7倍和15倍。2.对iFA3、iNK和FA3、NK的酶学性质进行测定并分析发现,i FA3与FA3的最适p H均为3.0,固定化的处理对FA3的p H改变适应性影响甚微,而NK在经过固定化处理之后的最适p H发生明显的酸移,从p H 6.0变为p H 3.0,并且i NK对p H改变的适应性显著增强。FA3、NK的最适温度为50℃,固定化处理之后它们的最适温度提升为60℃,并且对温度改变的适应能力均有明显的增强。固定化的处理显著增强了FA3和NK在酸性到弱碱范围内的稳定性以及热稳定性。固定化处理极大的改善了纳豆激酶的储存稳定性,ifa3的储存半衰期为58天,i NK的储存半衰期为86天,而FA3和NK分别在储存80天、第90天后酶活基本丧失。在重复使用20次后,i FA3、i NK的酶活力仍均能保持在初始酶活的50%以上,它们的操作半衰期分别为25次、37次,固定化的处理使纳豆激酶稳定的重复使用成为可能。相对于FA3、NK,i FA3和i NK对唾液、模拟胃液、模拟肠液的消化抗性有了极大的提升,其中对模拟胃液及模拟肠液的消化抗性的提升尤为显著。i FA3和i NK在经过模拟胃液消化120 min之后,酶活力依然分别能保持初始酶活力的60%、65%以上,在经过模拟肠液消化12 h之后,酶活力均能保持初始酶活力的60%以上,远远高于游离纳豆激酶对初始酶活力的保留。3.使用间接酶联免疫吸附测定法(间接ELISA),对i FA3、i NK以及FA3、NK对细胞外β-淀粉样蛋白1-42(Aβ42)的单体、寡聚体、纤维(Aβ42单体、寡聚体、纤维分别缩写为Aβ42M/Aβ42O/Aβ42F)三种形式的降解效果进行测定分析并比较,发现固定化的处理使纳豆激酶对Aβ42M/Aβ42O/Aβ42F的降解率有一定的提升,并且显著提升了纳豆激酶对Aβ42M/Aβ42O/Aβ42F的降解速率。综上所述,纳豆激酶经固定化处理之后,不但提高了酶活力及稳定性,而且加快了纳豆激酶对Aβ42的降解速率、提升了纳豆激酶对Aβ42的降解水平。并且该固定化酶的制备条件简单、成本低、安全性能良好,为纳豆激酶的合理应用奠定基础,对纳豆激酶口服制剂的研制提供新思路,显著提升了纳豆激酶在医药方面应用的潜力。