槲皮素激活Nrf2信号通路改善大鼠大脑缺血再灌注损伤研究

作     者：李琼璘 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘辉;王新兴

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：槲皮素 大鼠 PC12 MCAO OGD/R Nrf2 

摘      要：目的:探讨槲皮素激活核因子E2相关因子-2（Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2）信号通路对大脑缺血再灌注损伤的作用及其机制,为减轻缺血再灌注损伤提供理论依据。方法:1.体外实验:（1）以无糖培养基与低氧工作站（5%CO,94.5%N,0.5%O）建立大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（高分化型）PC12细胞的糖氧剥夺/再灌注（Glucose and oxygen deprivation/reperfusion,OGD/R）模型,糖氧剥夺6小时,再灌注12小时,用梯度浓度的槲皮素干预。（2）CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞活性,初步筛选槲皮素最佳剂量范围。（3）流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平,四甲基罗丹明乙酯（Tetramethylrhodamine,ethyl ester,TMRE）检测线粒体膜电位水平。（4）免疫荧光指示Nrf2在细胞中的位置,蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测总Nrf2与核Nrf2及其相关信号通路蛋白:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch like epichlor-ohydrin related protein 1,Keap1）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC）、NAD（P）H:醌氧化还原酶1(NAD（P）H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)、选择性自噬接头蛋白（sequestosome 1,P62/SQSTM1）的表达。（5）小干扰RNA（Small Interfering Ribonucleic Acid,si RNA）沉默Nrf2的表达,实时荧光定量PCR（Real-Time q PCR,RT-q PCR）检测m RNA的表达。（6）检测Nrf2表达被抑制后相关通路蛋白的表达。检测细胞的凋亡率、细胞内ROS水平、超氧阴离子水平,验证Nrf2是否是槲皮素的作用靶点。2.体内实验:（1）在大鼠体内用线栓法建立大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Obstruction,MCAO）模型:栓塞2小时后恢复血流供应,再灌注72小时;再灌注开始时给予不同剂量槲皮素（10 mg/kg·bw、25 mg/kg·bw、50 mg/kg·bw）腹腔注射。（2）2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride solution,TTC）染色检测大鼠脑梗死体积,改良神经系统缺损程度评分（Modified Neurological Severity Score Points,m NSS）进行大鼠行为学评价。（3）用免疫荧光的TUNEL（d T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）染色检测大脑梗死侧神经元凋亡,苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色、尼氏（Nissl）染色检测大鼠脑皮层病理损伤情况。（4）透射电镜检测线粒体形态。（5）硫代巴比妥酸（Thibabituric Acid,TBA）法检测大鼠血清中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量,羟胺法检测血清总超氧化物歧化酶（Total-Superoxide dismutas,T-SOD）含量。（6）免疫荧光指示Nrf2的分布与入核情况,Western Blot检测总Nrf2与其相关信号通路蛋白Keap1、HO-1、GCLC、NQO1的表达。结果:1.体外实验:（1）在常规培养条件下,与对照组（Ctrl）相比,槲皮素各剂量组的细胞活性无明显改变,差异无统计学意义;与Ctrl组相比,糖氧剥夺/再灌注（OGD/R）组的细胞活性显著下降,且差异有统计学意义（P0.01）;与OGD/R组相比,槲皮素1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L三个剂量组细胞活性均显著提高,差异有统计学意义（P0.05）。（2）与Ctrl组相比,OGD/R组细胞凋亡率显著上升,且差异有统计学意义（P0.01）;与OGD/R组相比,三组槲皮素干预组的细胞凋亡率均降低,其中5μmol/L剂量组的细胞凋亡率降低最明显,差异有统计学意义（P0.01）。ROS实验结果显示,相较于Ctrl组,OGD/R组的细胞内ROS水平翻倍升高,且差异有统计学意义（P0.01）;与OGD/R组相比,三组槲皮素干预组ROS水平均降低,5μmol/L组ROS水平下降最明显,差异有统计学意