白念珠菌小分子热休克蛋白Fmp28的致病功能及机制初探

作     者：谈军军 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄孝天;曾令兵

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：白念珠菌 Fmp28 Als3 毒力 调控机制 

摘      要：背景:小分子热休克蛋白(s Hsp)是一类分子量低于30 k D、具有DNL类型锌指结构的、且高度保守的蛋白质,可作为分子伴侣协助蛋白质运输并阻止有害蛋白质的聚集。在某些压力(如热、渗透和细胞壁合成受阻等)应激下该类蛋白在白念珠菌中的表达量明显上调,进而维持其生存能力和感染能力。因此,该类小分子热休克蛋白可作为毒力因子,促进白念珠菌形态转换、生物被膜形成、黏附能力,提示小分子热休克蛋白可能成为抗真菌药物的潜在靶点。本课题结合实验室前期结果和CGD(Candida Genome Database)数据库鉴定出白念珠菌一个新的蛋白Fmp28,其分子量为21 k D,属于s Hsp亚家族,预测是白念珠菌内一种具有分子伴侣活性的热休克蛋白。目前该蛋白在白念珠菌中的研究甚少,其是否影响白念珠菌的毒力以及相关的调控机制仍是未知的。目的:明确Fmp28分子的生物学功能,并且深入探究其作为毒力因子在白念珠菌的致病过程中的功能及分子机制。方法:1.借助同源重组遗传手段构建白念珠菌一系列的菌株如敲除株、回补株、过表达菌株以及标签菌株:以SN152为亲本株,构建敲除株fmp28Δ/Δ和标签菌株Fmp28-3HA;以fmp28Δ/Δ为亲本株,构建回补株fmp28AB和过表达菌株fmp28Δ/Δ+als3、fmp28Δ/Δ+pra1、fmp28Δ/Δ+csa1;以SN250为亲本株,构建过表达菌株fmp28、als3、pra1、csa1;2.采用以下方法确证Fmp28作为热休克蛋白分子的生物学功能:通过测定生长曲线和平板滴定实验,比较WT(SN250)、fmp28Δ/Δ、fmp28AB、fmp28生长速度差异;通过RT-q PCR和Western Blot实验,分别检测在热应激、渗透压力、细胞壁压力下fmp28的m RNA水平变化和Fmp28的蛋白表达量变化;3.采用以下方法探究白念珠菌Fmp28与致病功能之间的联系:(1)通过平板滴定实验,比较WT(SN250)、fmp28Δ/Δ、fmp28AB在30℃和37℃条件下对细胞壁干扰剂(CGR、CFW、Caspofungin)的敏感程度;(2)将WT(SN250)、fmp28Δ/Δ、fmp28AB接种于RPMI 1640和Spider液体和固体培养基进行菌丝诱导,比较37℃下Fmp28对于白念珠菌菌丝发生和延伸生长的影响;(3)将WT(SN250)、fmp28Δ/Δ、fmp28AB、fmp28菌株置于Spider液体培养基中培养,比较其黏附能力和生物被膜形成;(4)将WT(SN250)、fmp28Δ/Δ菌株与HUVEC细胞分别共孵育1 h、2h、3 h,检测37℃下Fmp28对白念珠菌对内皮细胞的黏附能力的影响;(5)通过构建小鼠系统性感染模型,比较WT(SN250)、fmp28Δ/Δ、fmp28AB菌株感染小鼠和大蜡螟后的生存曲线、小鼠肾脏和肝脏载菌量;4.采用以下方法探明白念珠菌Fmp28的致病机制:(1)将WT(SN250)、fmp28Δ/Δ接种于RPMI 1640液体培养基诱导2h,提取RNA样本后进行转录组测序分析,比较差异表达基因的表达水平变化,筛选出与生物被膜、黏附能力、毒力有关的基因,并经过RT-q PCR验证转录组分析结果;(2)比较fmp28Δ/Δ和fmp28Δ/Δ+als3、fmp28Δ/Δ+pra1、fmp28Δ/Δ+csa1的生物被膜形成差异和黏附能力差异;(3)通过构建小鼠系统性感染模型和大蜡螟模型,比较WT(SN250)、fmp28Δ/Δ、fmp28AB和fmp28Δ/Δ+als3感染小鼠和大蜡螟后的生存曲线、小鼠肾脏和肝脏载菌量、血清生化指标(UREA)、肾脏损伤分析;结果:1.本课题涉及的所有遗传重组菌株如fmp28Δ/Δ、fmp28AB、fmp28、fmp28Δ/Δ+als3、fmp28Δ/Δ+pra1、fmp28Δ/Δ+csa1、als3、pra1、csa1和Fmp28-3HA菌株均构建成功;2.生长速率测定结果显示fmp28Δ/Δ较于SN250、fmp28AB和fmp28,在37℃下表现出明显的生长缺陷(P0.05),30℃下并无生长差异;白念珠菌在受到热应激、渗透压力、细胞壁压力时,Fmp28蛋白表达量增加以及其编码基因fmp28的m RNA水平上升(P0.01);3.结果显示:(1)fmp28Δ/Δ相较于SN250和fmp28AB,在液体培养基中其菌丝长度明显缩短,在固体培养基上的菌落形态不规则,菌落中心无明显褶皱,边缘粗糙,菌丝生成较少,酵母-菌丝态转换能力明显减弱;(2)在热压力(37℃)条件下,加入外源的细胞壁扰试剂如CGR,fmp28Δ/Δ的生长缺陷更加显著,对细胞壁压力的敏感性显著增加;(3)以聚苯乙烯为黏附介质,fmp28Δ/Δ相较于SN250和fmp28AB,表现出黏附能力的明显缺陷(P0.001);若以HUVEC细胞为黏附介质,fmp28Δ/Δ在1 h、2 h和3 h的黏附率均显著低于SN250(P0.001);(4)在Spider诱导条件下,fmp28Δ/Δ相较于SN250和fmp28AB,结晶紫染色法和干重法检测的生物被膜形成均显著减少(P0.001),(5)在小鼠系统性感染模型中,白念珠菌无论是处于高剂量(5×10cfu)还是低剂量(5×10cfu)的情况,fmp28Δ/Δ相较于SN250和fmp28AB,死亡率显著下降,死亡时间明显滞后,肾脏载菌量明显下降(P0.05),表现出显著的毒力缺陷(P0.001);4.Fmp28调控白念珠菌毒力的实验结果显示:(1)转录组数据显示,fmp28Δ/Δ菌株相较于SN250,als3、pra1、csa1转录水平明显下调;结合CGD数据库分析显示,Fmp28可能通过调控als3、pra1、csa1影响白念珠菌的生物被膜形成、黏附过程及毒力;RT-q PCR结果显示fmp28Δ/Δ菌株als3、pra1、csa1的m RNA水平明显下调(P0.05);(2)fmp28Δ/Δ+als3、fmp28Δ/Δ+pra1、fmp28Δ/Δ+csa1相较于fmp28Δ/Δ黏附能力显著性增强(P0.01),生物被膜形成显著增加(P0.05),确定als3、pra1、csa1位于fmp28下游,Fmp28通过调控als3、pra1、csa1表达促进白念珠菌的黏附进程,进而促进生物被膜形成;(3)大蜡螟模型和小鼠系统性感染模型的生存曲线结果显示,fmp28Δ/Δ组相较于SN250组和fmp28AB组,死亡率下降并且死亡时间滞后,而fmp28Δ/Δ+als3组相较于fmp28Δ/Δ组死亡率上升和死亡时间提前;此外fmp28Δ/Δ+als3在肾脏和肝脏的载菌量与fmp28Δ/Δ组并无差异;而与肾脏有关的细胞因子UREA水平结果和肾脏损伤病理评估结果均显示,fmp28Δ/Δ+als3组相较于fmp28Δ/Δ组小鼠的肾脏损伤程度有所增加(P0.05);这些结果显示als3表达水平升高可一定程度恢复fmp28缺失导致的毒力缺陷,提示在毒力调控通路中,als3位于fmp28下游。结论:1.Fmp28在白念珠菌中作为小分子热休克蛋白发挥功能;2.Fmp28缺失会导致白念珠菌菌丝、生物被膜、黏附能力缺陷,对热压力下细胞壁压力的敏感性增加,进一步影响动物系统性感染模型中的毒力;3.白念珠菌Fmp28通过调控Als3表达水平,影响黏附过程和生物被膜形成从而促进毒力。