压力加载对人肝细胞DNA损伤的影响

作     者：唐艳萍 

作者单位：重庆大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋关斌

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：压力加载 肝细胞 DNA损伤 ERK1/2-Dicer信号 

摘      要：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种具有高发生率和高死亡率的原发性肝癌,主要发生于肝硬化肝脏中。肝细胞癌的发生与肝脏组织的力学性质(固体应力、间质液压力和细胞外基质刚度)变化密切相关。这些力持续作用于肝脏组织内的细胞,并影响它们的生物学行为。研究发现,力学作用能导致细胞DNA损伤,如果此损伤不加以修复,会影响细胞基因组的稳定性,增加正常细胞癌变的几率。但肝脏病变过程中肝组织力学环境的改变对肝细胞DNA损伤的影响以及其中涉及的分子机制尚不清楚。因此,探究力学因素对肝细胞DNA损伤的调控及机制,更好地了解机械力对肝细胞功能的影响,对发现新的干预措施预防HCC的发生发展具有重要意义。基于此,本研究设计、制作了一种体外细胞压力加载装置,用于模拟正常门静脉压力和肝硬化时期的门脉高压,以人正常肝细胞为研究对象,探讨了压力加载对肝细胞DNA损伤的影响和相关分子机理。主要研究内容和结果如下:(1)压力加载对肝细胞DNA损伤的影响将肝细胞置于压力加载装置中,给予不同大小的压力(5、20、40 mm Hg)加载,48 h后分别通过彗星实验、Western blot、免疫荧光、CCK8、流式细胞术和RT-q PCR检测压力对肝细胞DNA损伤、损伤修复、细胞增殖、细胞周期以及炎症因子和肝细胞功能基因表达的影响。结果显示,高压力作用下肝细胞的DNA损伤程度增加,DNA修复蛋白如磷酸化的H2AX组蛋白(phosphorylated histone H2AX,γ-H2AX)和p53结合蛋白1(p53 binging protein1,53BP1)的表达增加,细胞增殖能力降低,细胞周期阻滞在S期。RT-q PCR检测了压力作用下肝细胞中炎症因子和特异性功能基因的表达变化,结果发现炎症因子呈压力梯度依赖式增加,特异性功能基因的表达随压力升高而下调。(2)Dicer在压力诱导肝细胞DNA损伤中的作用Dicer作为诱导DNA损伤修复因子募集的关键分子,在DNA损伤反应中发挥重要作用。通过Western blot检测压力加载条件下肝细胞中Dicer的表达情况,实验结果显示,随着压力的升高,肝细胞中Dicer的表达水平随之增加。为了确定Dicer在压力调控肝细胞DNA损伤中的作用,利用特异性siRNA敲减肝细胞中的Dicer,结果发现:较高压力条件下培养的肝细胞中DNA损伤程度相较于未敲减Dicer组显著增加;敲减Dicer导致细胞中DNA修复蛋白γ-H2AX和53BP1的表达水平降低;敲减Dicer也导致肝细胞S期细胞分布的比例下降,而进入G1期细胞的数量增加。结果提示,压力加载通过Dicer信号影响DNA损伤反应调控肝细胞的DNA损伤程度。(3)ERK1/2在压力调控肝细胞DNA损伤中的作用细胞外调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)是调控细胞DNA损伤的关键响应通路,并且ERK1/2的磷酸化水平受力学因素变化的调控。通过Western blot检测总的ERK1/2和磷酸化的ERK1/2在不同压力条件下肝细胞中的表达情况,结果发现:在压力加载下肝细胞总的ERK1/2表达没有明显变化,但p-ERK1/2的表达水平随着压力的升高而增加,提示ERK1/2信号分子被活化。采用ERK1/2信号分子的抑制剂抑制ERK1/2信号后,结果显示,ERK1/2信号通路阻断能显著抑制较高压力条件下肝细胞中Dicer的表达,使DNA损伤积累,γ-H2AX和53BP1的表达下调以及细胞周期阻滞在G1期。结果表明,ERK1/2分子在压力通过Dicer表达调控肝细胞DNA损伤中起重要信号介导作用。综上,本研究工作考察了压应力加载对肝细胞DNA损伤的影响,结果证实压力加载可能通过ERK1/2-Dicer信号通路诱导肝细胞DNA损伤。该研究结果为深入认识肝脏病变过程中肝组织力学微环境改变对肝细胞功能的损伤及其力学生物学机制提供了实验依据,也为临床上肝细胞癌的防治提供了理论基础。