鸭源性H6N6亚型禽流感病毒感染小鼠及在人肺组织复制的研究

作     者：李程颐 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张增峰

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：禽流感病毒 H6N6亚型 跨种属传播 哺乳动物 基因特征 

摘      要：目的:H6N6亚型禽流感病毒在野生鸟类和禽类动物中广泛流行,病毒持续进化演变,其宿主范围逐渐由禽类动物扩大至哺乳动物,部分病毒甚至具有识别和结合人型SAα-2,6Gal受体的能力。令人担忧的是,一些暴露人群的血清中H6亚型禽流感病毒特异性抗体检测呈阳性。因此,H6N6亚型禽流感病毒具有跨种属屏障感染哺乳动物甚至感染人的潜能。研究证实,陆禽动物鹌鹑、鸡等是禽流感病毒跨种属传播至人的中间宿主,水禽家鸭有助于禽流感病毒传播至陆禽动物,但鸭源性的H6N6亚型禽流感病毒是否能跨种属屏障直接传播至哺乳动物和人还尚未清楚。本研究应用分离自水禽鸭源性的H6N6亚型禽流感病毒,应用基因测序和进化分析,明确H6N6亚型禽流感病毒起源和各基因片段主要关键氨基酸位点的变化;然后应用病毒接种小鼠、人呼吸道组织,观察病毒对小鼠的致病性及在人呼吸道组织的复制能力,初步探索来自水禽鸭源性的H6N6亚型禽流感病毒是否具有感染哺乳动物小鼠及人的潜能,为进一步探究H6N6亚型禽流感病毒的跨种属传播奠定基础。方法:1.禽流感病毒的扩增及HA效价、EID、TCID测定:将3株水禽鸭源性H6N6亚型禽流感病毒A/DK/KM/1135/2019(简称KM1135)、A/DK/GY/1774/2019(简称GY1774)、A/DK/GY/6952/2019(简称GY6952)在鸡胚中进行扩增,收获鸡胚尿囊液,对尿囊液进行HA效价、EID、TCID测定,以扩增本研究所需要的病毒量、明确接种小鼠和人呼吸道组织所使用的病毒浓度。2.基因测序和进化分析:提取病毒的RNA进行逆转录,PCR扩增c DNA后纯化扩增产物,采用Illumina公司的Solexa系统上机检测病毒全基因序列,Mega 7.0和Bioedit 7.0.9进行序列比较,分析H6N6亚型禽流感病毒各基因片段的变化。3.禽流感病毒体内感染BALB/c小鼠:通过滴鼻、滴眼的方式对小鼠进行病毒接种感染,感染后每天记录小鼠体重、体温、精神状态等。感染后3 d、5 d、7 d、14 d分别采集各组小鼠的咽拭子和血液。感染后3 d、5 d、7 d分别麻醉处死3只小鼠,处死后采集鼻甲、气管、肺组织,一半研磨匀浆后进行病毒的分离培养;另一半放入10%福尔马林中固定,用于HE染色及免疫组化染色。4.禽流感病毒在人肺组织的复制:收集病人的呼吸道手术切除标本,将标本切成小组织块后体外接种病毒。接种后12 h、24 h、36 h、48 h、72h分别收集组织培养液和2块组织块,一块组织块磨匀浆后进行病毒的分离培养;另一块放入10%福尔马林中固定,用于HE染色及免疫组化染色。结果:1.禽流感病毒扩增后的HA效价及EID、TCID检测结果:3株病毒扩增后,KM1135病毒株的HA效价、EID值、TCID值最高,病毒的感染能力和致病性最强;GY6952病毒株的HA效价、EID值、TCID值最低,病毒的感染能力和致病性最弱。2.基因测序和进化分析结果:3株病毒HA裂解位点序列均为PQIETR/GL,为单个碱性氨基酸裂解位点,符合低致病性禽流感病毒特征。3株病毒的HA除发生H156K突变以外,其余224、226、228、190、137等关键氨基酸位点均未发生突变,仍具有与禽型SAα-2,3Gal受体结合的特性。病毒NA、PB1、PB2、PA的多个关键氨基酸位点也未发生突变,病毒仍属于禽流感病毒的基因特点。3.禽流感病毒感染BALB/c小鼠实验结果:在小鼠体内感染实验中,3株病毒感染后小鼠未出现明显的症状,感染过程未出现小鼠死亡情况。KM1135和GY1774病毒株接种小鼠后,小鼠咽拭子标本、鼻甲、气管、肺组织研磨液标本病毒分离培养阳性,组织病理学检查显示小鼠鼻甲、气管、肺组织出现炎症反应,组织内流感病毒NP抗原检测阳性,以KM1135最为典型。GY6952病毒株接种小鼠后,肺组织研磨液病毒分离培养阳性,而咽拭子标本、鼻甲、气管组织研磨液标本病毒分离培养为阴性,组织病理学检查显示小鼠肺组织出现炎症反应而鼻甲、气管组织未见明显病理改变,在鼻甲、气管、肺组织内均未检测出流感病毒NP抗原。3株病毒感染后,小鼠血清标本中流感病毒特异性抗体为阳性,且抗体HI滴度随着感染后天数而增高。4.禽流感病毒在人肺组织的复制实验结果:在人呼吸道组织体外感染实验中,KM1135病毒株感染后的人支气管、肺组织培养液、研磨液标本病毒分离培养阳性,组织病理学检查显示人支气管、肺组织均出现炎症反应,肺泡组织内流感病毒NP抗原检测阳性,而支气管组织内流感病毒NP抗原检测阴性。GY1774病毒株感染后的人支气管、肺组织培养液、研磨液标本病毒分离培养阳性,组织病理学检查显示人支气管、肺组织出现炎症反应,支气管和肺泡组织内流感病毒NP抗原检测阳性。GY6952病毒株感染后的人支气管、肺组织培养液、研磨液标本病毒分离培养阳性;组织病理学检查显示人支气管、肺组织出现炎症反应,肺泡组织内流感病毒NP抗原检测阳性而支气管组织内流感病毒NP抗原检测阴性。结论:1.鸭源性H6N6亚型禽流感病毒HA裂解位点仍属于低致病性禽流感病毒特征,病毒除发生HA的H156K突变以外,其余多个关键氨基酸位点均未发生突变,病毒仍属于禽流感病毒的基因特点。2.鸭源性H6N6亚型禽流感病毒无需适应就可以直接跨种属屏障感染BALB/c小鼠,感染部位主要为小鼠的鼻甲、气管、肺组织,表明该类病毒可跨种属屏障感染哺乳动物小鼠。3.鸭源性H6N6亚型禽流感病毒可在人呼吸道组织中进行有效复制,病毒复制的部位主要为肺组织,提示该病毒具有跨种属屏障从水禽鸭直接感染人的潜能。