从AMPK/PGC-1ɑ/NRF-1途径探讨巨刺法改善MCAO大鼠神经损伤的作用机制

作     者：胡梦艺 

作者单位：福建中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨珊莉

授予年度：2022年

学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学] 

主      题：脑卒中 巨刺法 运动障碍 MCAO AMPK 

摘      要：目的:本课题拟对大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠侧脑室注射AMPK抑制剂,从AMPK/PGC-1α/NRF-1途径探讨巨刺曲池穴、足三里穴改善MCAO大鼠运动障碍的机制,为临床同类研究提供新靶点及研究基础。方法:将75只280±20g的雄性大鼠,随机等分为假手术、模型组、巨刺组、巨刺+Compound C组(Cmpound C为AMPK抑制剂)和巨刺+PBS组(为说明侧脑室注射的操作不会对实验结果造成明显影响的阴性溶剂对照组)。MCAO模型制备后参照ZeaLonga评分判定大鼠是否模型制备成功,将评分1-3分的大鼠纳入实验,干预前进行磁共振T2WI扫描计算梗死体积,m NSS评分和旷场试验评估神经功能和运动能力。选取巨刺组、巨刺+Compound C组以及巨刺+PBS组大鼠进行左侧肢体的曲池、足三里穴进行电针干预,30 min/次/天,共7天。假手术组和模型组同等条件下模拟抓取。干预结束后,旷场试验测试、Cat Walk步态分析系统检测大鼠的运动功能。功能检测结束后,扫描磁共振T2WI计算梗死体积、免疫荧光法观察神经元表达情况、透射电镜观察神经元内线粒体超微结构和相对数量、通过磷钼酸比色法测定ATP含量、Westernblot法检测AMPK、p-AMPK、PGC-1α及NRF-1蛋白的相对表达。结果:1.神经功能评分结果:干预前,除假手术组外,MCAO模型大鼠m NSS评分升高,基线一致(P0.05),提示造模成功。干预后,对比模型组,巨刺组m NSS评分较低(P0.05)。2.旷场试验结果:干预前,除假手术外,各组大鼠总运动路程减少(P0.05),基线一致。干预后,对比模型组,巨刺组的大鼠的总运动路程较长(P0.05)。3.Cat Walk步态分析结果:3.1站立时间:干预后,对各组大鼠站立相时间进行定量分析,以评估病理步态严重程度。与假手术组相比,模型组大鼠四肢的站立时间均有延长(P0.05)。3.2摆动速度:干预后,对各组大鼠摆动速度进行定量分析,以评估病理步态严重程度。与假手术组相比,模型组大鼠四肢的摆动速度均有下降(P0.05)。3.3步长:干预后,对各组大鼠四肢步长进行定量分析,以评估病理步态严重程度。与假手术组相比,模型组大鼠四肢的步长均缩短(P0.05)。4.磁共振扫描计算梗死体积:干预前,除假手术组外,各组MCAO模型大鼠均可见白色梗死区,软件标记梗死区并计算体积后结果显示各组之间无差异(P0.05)。干预后,结果显示,对比干预前,MCAO模型制备的四组大鼠梗死体积均有下降。对比模型组,巨刺组梗死体积百分比较小(P0.05)。5.免疫荧光染色观察NeuN表达:干预后,与假手术组相比,其余四组的NeuN阳性细胞表达个数较少(P0.05)。6.透射电镜观察线粒体超微结构和数量:干预后,通过透射电子显微镜对神经元内线粒体结构的观察结果显示,与假手术组相比,模型组线粒体嵴结构模糊,形态较圆、长度缩短,可见絮状样变,神经元核组织疏松、水肿,核周围线粒体数量较少;与模型组相比,巨刺组线粒体嵴结构较清晰,形态呈短棒状,线粒体数量较多。对比巨刺组,巨刺+Compound C组线粒体嵴结构断裂、模糊,出现絮状样变,线粒体数量减少;对比巨刺组,巨刺+PBS组的线粒体超微结构和数量差异不明显。7.磷钼酸比色法测定ATP含量:干预后,与假手术相比,模型组ATP含量降低(P0.05)。8.Western-blot检测通路蛋白表达:干预后,与假手术组相比,模型组的pAMPK、PGC-1ɑ、NRF-1蛋白表达相对降低(P0.05);对比巨刺组,巨刺+PBS组的p-AMPK、PGC-1ɑ、NRF-1蛋白表达无统计学差异(P0.05)。结论:1.巨刺“曲池、足三里可改善MCAO大鼠运动功能障碍。2.巨刺“曲池、足三里有益于MCAO大鼠线粒体超微结构修复、增加神经元核周围线粒体数量、改善缺血侧脑组织能量供应。3.AMPK/PGC-1ɑ/NRF-1通路蛋白参与了巨刺法对MCAO大鼠的神经保护作用。