红系条件性敲除促红细胞生成素受体EpoR对小鼠红系发育的影响

作     者：李妍 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：安秀丽

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：EpoR Epo 红系发育 红系条件性基因敲除小鼠模型 造血发育 

摘      要：作为人体含量最丰富,也是血液中数量最多的一类细胞,红细胞在体内氧气运输过程中发挥着重要作用。红细胞的产生过程被称为红系发育,它是指造血干细胞经历一系列的细胞分裂、分化最终生成成熟红细胞的过程,期间受到复杂而精细的调控。其中促红细胞生成素及其受体(Epo/EpoR)对红系细胞的增殖、分化以及生存至关重要,在红系发育过程中发挥着不可或缺的调控作用。在之前的研究中,全身性EpoR基因缺失小鼠(EpoR)的胎肝红系祖细胞成熟存在严重障碍,导致其于妊娠13-15天死亡;而同窝的EpoR单倍剂量成体小鼠(EpoR)则表现出中度贫血,其骨髓红系祖细胞数量减少、有核红细胞发育受到抑制。由于长期以来人们都认为EpoR特异性表达于红系细胞,因此全身性EpoR基因缺陷小鼠出现的造血障碍被认为就是红系细胞EpoR的表达受到影响所致。然而,随着研究的深入,越来越多的证据表明EpoR在多种非红系细胞表面也有一定的表达。值得注意的是,本课题组最近的研究显示EpoR在骨髓造血干祖细胞、红系造血岛巨噬细胞、与衰老或者损伤红细胞清除密切相关的脾脏红髓巨噬细胞以及肝脏Kupffer细胞上均有表达。这表明全身性敲除EpoR不仅会影响红细胞本身,还可能会影响造血谱系早期发育,或是通过改变红系发育的微环境甚至红细胞生命周期而间接影响了体内红细胞的生成和存活。因此,早期研究中EpoR全身性敲除小鼠出现的发育异常表现,可能是由多种类型细胞功能改变共同导致的,红系细胞特异性EpoR表达缺失对红细胞发育过程的影响并不明确。为了细化EpoR在机体中的作用,本课题旨在通过Cre/Lox P系统,获得特异地在红系细胞中敲除EpoR基因的小鼠模型,更精细地探索EpoR在体内红系发育过程中发挥的作用及机制。血型糖蛋白A(Glycophorin A,Gypa)是红细胞膜上含量最高的唾液糖蛋白,在红细胞中特异性高表达,长期以来被作为红系特异性标记物,因此本课题选择Gypa作为靶点构建工具小鼠模型用于特异性研究红系发育。我们首先根据数据库中Gypa和EpoR基因的序列信息,结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计并构建出两种不同打靶策略的基因敲入小鼠模型:Gypa-td Tomato-i Cre和EpoR-e GFP-Lox P。基因型鉴定、Western Blot鉴定、血常规检测和骨髓红系发育进程检测等证明构建的两种小鼠外源敲入序列均成功在小鼠体内表达且发育正常。随后,本研究利用流式细胞术对两种小鼠荧光表达进行检测,证明Gypa-td Tomato在红系细胞特异性高表达;且EpoR-e GFP也能够准确地反映EpoR在各阶段红系细胞表面的表达趋势。此外,Gypa-td Tomato-i Cre与Rosa26-loxp-stop-loxp-EYFP报告小鼠交配后代的流式检测结果表明Cre酶具有在红系细胞(从红系祖细胞到晚幼红细胞)高效地切割目的基因的效率。随后,本研究将Gypa-td Tomato-i Cre与EpoR-e GFP-Lox P小鼠进行交配以获得红系细胞特异性敲除EpoR小鼠。对小鼠杂交后代的基因型进行统计发现新生仔鼠数量少且不符合孟德尔遗传定律,无纯合EpoR缺失小鼠(EpoRGypa-i Cre)出生。因此,本课题检测了E12.5(Embryo 12.5)时期EpoRGypa-i Cre小鼠胚胎,发现其红系发育出现严重障碍,无定向红细胞产生;E14.5时期的小鼠已不能维持正常胚胎形态。而相应的,同窝EpoR单倍剂量小鼠(EpoRGypa-i Cre)正常存活且可育,但表现出中度贫血。血常规检测结果显示其RBC、HGB、HCT等红系相关指标显著降低;此外,该小鼠脾脏也出现了明显代偿性造血。本课题接下来以EpoRGypa-i Cre小鼠为模型详细分析EpoR单倍剂量不足对小鼠成体红系发育的具体影响。统计结果显示:与EpoR小鼠不同,EpoRGypa-i Cre小鼠骨髓总细胞数、Ter119细胞数均显著增加。全骨髓细胞克隆形成实验结果证明EpoRGypa-i Cre小鼠骨髓中红系祖细胞BFU-E和CFU-E数量均显著增多,这也与EpoR小鼠CFU-E细胞减少的表型不同。然而当对红系终末分化进行检测时发现,EpoRGypa-i Cre小鼠骨髓中有核红细胞的生成并没有随红系祖细胞的显著扩增而增加。随后本课题利用分选获得的BFU-E和CFU-E细胞进行克隆形成实验,发现其克隆形成的能力均显著下降;这表明EpoRGypa-i Cre小鼠终末分化进程存在明显缺陷。接着本课题又分析了EpoRGypa-i Cre小鼠红系发育障碍是否对上游的造血干祖细胞稳态有影响,流式检测结果显示该小鼠骨髓中造血干细胞减少,而巨核-红系祖细胞的比例和数量均明显增加。这提示本研究中红系细胞EpoR单倍剂量小鼠的