负载铈-LTA-沸石水凝胶的制备及中和炎症因子清除ROS促进糖尿病伤口愈合的研究
作者单位：锦州医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：赵亮
授予年度：2022年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：目 的糖尿病(diabetes)是一种终身性疾病,其发病原因为胰岛功能障碍导致的代谢性疾病,主要特点为持续性高血糖。当机体长期处于高血糖环境,便会引发如慢性伤口溃烂等严重糖尿病并发症,从而危机人类生命健康。本课题制备一种Ce@LindeA型沸石基纳米颗粒(Ce@LTA-NPs),利金属铈的混合价态以及纳米沸石的强大吸附能力清除细胞内活性氧簇(ROS)及炎症因子,同时促进创面血管快速形成。并将其载入抗菌温敏水凝胶(F127/CS hydrogel)。通过细胞实验、抗菌性能分析、以及动物药效学分析对复合水凝胶加速慢性创面愈合进行研究。方 法以硅酸钠、硅酸铝、四水合硫酸铈为原料,采用溶剂热方法制备金属铈掺杂的纳米沸石,并以铈-LTA-沸石、壳聚糖、Pluronic F127粉末为原料,制备多功能复合水凝胶。根据铈-LTA-沸石的释放情况进行处方优化。采用扫描电镜(SEM)透射电镜(TEM)、X射线衍射仪(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)、红外吸收光谱法(FT-IR)等,对其表面形貌、结构进行表征。溶血实验、苏木素-伊红染色(H&E)实验、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)用于评价铈-LTA-沸石的生物安全性,细菌实验用于研究水凝胶的抗菌效果。在细胞实验中,通过CCK8实验考察铈-LTA-沸石对葡萄糖(30 mmoL/L)刺激人脐静脉内皮细胞(HG-HUVECs)后增殖能力的影响;超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒验证铈-LTA-沸石模拟细胞内天然酶的能力;铈-LTA-沸石的炎症吸附能力通过比表面及孔径测定、炎症因子的免疫荧光共定位实验及不同实验组中炎症因子表达情况综合证明;Transwell实验探究铈-LTA-沸石对HG-HUVECs细胞迁移能力的影响;体外血管形成实验考察铈-LTA-沸石加速血管生成情况;Western Blot实验检测HG-HUVECs细胞内蛋白表达的高低,包括肿瘤坏死因子(TNF-α),白介素-6(IL-6),血管内皮生长因子(VEGF),血管内皮生长因子受体2(VEGFR2),基质金属蛋白酶2(MMP2)等。最后,在SD大鼠中使用链脲佐菌素诱导1型糖尿病,在无菌环境下建立直径为2 cm的糖尿病创面模型进行动物药效学实验,观察不同给药组的伤口愈合情况,评价伤口愈合质量。结 果本文利用沸石吸附能力,建立了紫外分光光度法间接测定铈-LTA-沸石含量。用罗丹明B对铈-LTA-沸石进行标记,并且对其线性、日间精密度、日内精密度、回收率进行考察,均符合分析要求。根据铈-LTA-沸石水凝胶的释放情况对处方进行筛选,最终获得的铈-LTA-沸石水凝胶表面具有高孔隙率,铈-LTA-沸石均匀分散于水凝胶中。最优处方制备的水凝胶14小时累积释放率达88.3±3.16%。通过SEM进行水凝胶微结构的研究。结果表明,水凝胶显示出三维交联网状孔洞结构,一方面可以将Ce@LTA-NPs装入水凝胶,另一方面水凝胶中许多较小的孔可以在伤口周围快速吸收组织液。流变学实验表明,水凝胶粘度随剪切速率的增大而减小,加热时,弹性模量(G’)和粘性模量(G)均增加,并且随着温度的升高,G’和G发生交叉,表明水凝胶从溶胶状态到凝胶状态的转变。细胞实验中,通过MTT法测定Ce@LTA-NPs在一定范围内对HUVECs没有细胞毒性。线粒体产生的ROS可以被铈-LTA-沸石所清除,达到体内活性氧与抗氧化酶之间的平衡。并且50 μg/mL Ce@LTA-NPs处理组能显著促进HG-HUVECs迁移以及血管生成,Ce@LTA-NPs处理组的细胞迁移能力明显高于高糖刺激组。血管生成实验也表明用Ce@LTA-NPs处理后HG-HUVECs的血管腔数明显增多。Western Blot实验检测Ce@LTA-NPs对细胞内蛋白表达水平的影响。结果显示,高糖组中基质金属蛋白酶(MMP2)高表达说明高血糖导致细胞外基质过度降解,10 μg/mL Ce@LTA-NPs、50μg/mL Ce@LTA-NPs处理组MMP2蛋白表达水平降低,并且上调了 VEGFR2、VEGF的表达,促进了血管的生成。抗菌实验中,细菌涂板实验以及细菌活力值检测显示随着壳聚糖浓度的增加,细菌活力下降,在壳聚糖的介导下,复合水凝胶显示出对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)具有较强的杀菌性能。最后,我们将水凝胶涂抹在糖尿病大鼠皮肤创面,并根据伤口恢复的时间通过拍照进行愈合情况观察。通过H&E染色、Masson染色、CD31染色、免疫荧光实验观察糖尿病伤口的炎症消退、血管生成及胶原沉积的变化。结果证明,与模型组相比Ce@LTA-NPs-F127/CS水凝胶显著加速了伤口愈合。结 论本文将金属铈原位掺杂的纳米沸石作为活性氧清除剂,模拟超氧化物歧化酶及过氧
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