水牛不同闭锁程度卵泡的鉴定和卵泡液非靶向代谢组学研究

作     者：程隽如 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓彦飞;韦英明

授予年度：2020年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：水牛 卵泡闭锁 判定方法 非靶向代谢组学 

摘      要：卵泡闭锁是雌性哺乳动物卵泡发育过程中的正常生理现象,是健康卵泡选择的重要生理机制。对卵泡闭锁程度的判定和生理机制的研究,将有望改变卵泡闭锁的命运,提高母畜的繁殖效率。为此,本研究探讨适合水牛卵泡闭锁程度的判定方法,并运用非靶向代谢组学分析不同闭锁程度卵泡液的代谢特征,筛选不同闭锁程度的差异代谢物和卵泡闭锁相关的靶向代谢通路,为寻找水牛卵泡闭锁的代谢生物标志,了解水牛卵泡闭锁的机制奠定基础。1、探讨适合水牛卵泡闭锁程度的判定方法。运用卵泡外观形态观察、卵泡内部形态观察、雌激素(E2)和孕激素(P4)浓度比值三种方法,将水牛卵泡分为健康卵泡(HF)、早期闭锁卵泡(EF)和晚期闭锁卵泡(LF)。通过分析单个判定方法与综合判定方法之间的相互关系,形成适合水牛卵泡闭锁程度的判定方法。检测不同闭锁程度卵泡颗粒细胞的凋亡率和调控卵泡闭锁的基因表达水平,进一步验证判定方法的准确性。结果表明:(1)水牛卵泡闭锁过程中存在明显的内、外部形态变化,形态观察可用于水牛卵泡闭锁程度的初步判定。(2)水牛卵泡闭锁伴随着E2、P4明显的浓度差异,E2/P4比值可较为准确的判定闭锁程度,建议判定标准为HF:E2/P45;EF:1≦E2/P4≦5;LF:0E2/P41。(3)水牛卵泡闭锁过程中,卵泡各组分变化规律各异,E2/P4比值结合形态观察进行综合判定,比单一方法更准确地判别水牛卵泡的闭锁程度。(4)在综合判定方法中,卵泡颗粒细胞凋亡率随着闭锁程度的加深而显著升高(HF:11.35±0.69%,EF:18.53±0.43%,LF:28.78±0.64%,P0.05),抑制卵泡闭锁的基因FSHR、LHR、CYP19、Bcl-2表达量均显著降低(P0.05),促进卵泡闭锁的基因Caspase-3、Caspase-9、Bax表达量显著升高(P0.05)。2、水牛不同闭锁程度卵泡液的非靶向代谢组学分析。试验基于液相色谱-质谱(LC-MS)的代谢物全谱分析平台,结合多维统计分析(主成分分析PCA、偏最小二乘判别分析PLS-DA)和单维统计分析(t检验和倍数变化分析)筛选出各组间的显著性差异代谢物,并分别对HF vs EF、HF vs LF、EF vs LF组的差异代谢物进行KEGG通路富集分析,探究水牛卵泡闭锁潜在的靶向通路。结果表明,本试验成功鉴定出D-甘露糖、鞘磷脂、亚油酸、左旋肉碱、脱氢抗坏血酸等60个差异代谢物。其中,HF与EF组检测到27个差异代谢物,相对于HF,EF中有11种代谢物上调,16种代谢物下调;HF与LF组检测到47个差异代谢物,相对于HF,LF中有26种代谢物上调,21种代谢物下调;EF与LF组检测到10个差异代谢物,相对于EF,LF中有3种代谢物上调,7种代谢物下调。对差异代谢物进行KEGG通路富集分析发现,卵泡闭锁导致卵泡脂肪酸代谢紊乱、溶酶体膜通透化、谷胱甘肽合成减少和TCA循环减弱等代谢变化。以上结果表明:E2/P4比值结合形态观察能够排除主观因素的影响,达到准确判定水牛卵泡闭锁程度的目的;确定了水牛不同闭锁程度卵泡液的代谢特征,筛选出D-甘露糖、鞘磷脂、亚油酸、左旋肉碱、脱氢抗坏血酸等60种差异代谢物,发现卵泡闭锁与卵泡脂肪酸代谢紊乱、溶酶体膜通透化、谷胱甘肽合成减少和TCA循环减弱等代谢变化相关。