RELM-β调节Ca2+/PKC/ERK MAPK通路对低氧性肺动脉高压的作用机制研究

作     者：邢妍 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：戴爱国

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：肺动脉高压 缺氧 RELM-β 基因敲除 细胞周期蛋白 ERK MAPK信号通路 

摘      要：目的:观察RELM-β对低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)的影响,并探讨Ca/PKC/ERK MAPK通路是否通过上调细胞周期蛋白参与该过程的作用机制,从而诱导肺动脉平滑肌细胞增殖(Pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMCs)情况。方法:动物实验:观察RELM-β基因敲除对低氧大鼠肺血管形态、血流动力学及肺组织中RELM-β、PKC、ERK1/2表达的影响。取野生型(Wild type,WT)和RELM-β基因完全敲除型(RELM-β)两种SD雄性大鼠,将大鼠分别在常压常氧(21%O浓度)条件(Normoxia,H0)和每日持续8小时暴露在慢性常压低氧(10%O浓度),不间断连续21天(Hypoxia 21days,H21)的条件下进行培育,构建出HPH大鼠模型。将其分为四组,每组五只,分组为:H21+WT、H21+RELM-β、H0+WT、H0+RELM-β。该实验中,测量大鼠平均肺动脉压(Mean pulmonary arterial pressure,m PAP)采用右心导管法;右心室肥厚指数(Right ventricular hypertrophy index,RVHI)采用称重法,其公式为RVHI=RV/LV+S,以此指标来进行HPSR观察;观察肺动脉重塑程度用肺动脉壁厚度与血管外直径的比值(WT%)来表示;蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法测定RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2在肺组织中表达情况;实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)测定RELM-β的m RNA在肺组织中相对表达。细胞实验:检测野生型和RELM-β基因敲除型大鼠PASMCs缺氧状态下RELM-β、Ca浓度、p-PKC、p-ERK1/2、cyclin D1/E及CKD2/4蛋白含量,RELM-β经Ca/PKC/ERK MAPK对细胞周期及PASMCs增殖的调控作用。从RELM-β与WT大鼠中分离、提取原代PASMCs,并分别行低氧(把细胞放入1%O,94%N,5%CO的三气培养箱中孵育24h)和常氧(把细胞放入21%O,74%N,5%CO的培养箱中孵育)干预。细胞分组:H21+WT、H21+RELM-β、H0+WT、H0+RELM-β。选取H21+WT组对信号分子表达情况进行检测,同时研究PASMCs增殖的调控作用,通过加入信号通路相关因子抑制剂,检测下游因子磷酸化及PASMCs增殖情况来验证。抑制剂分别为:Ca内外螯合剂(BAPTA-AM+EGTA)、PKC抑制剂(LY317615)。用WB法测定PASMCs中RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2、cyclin D1/E及CKD2/4蛋白表达水平;q PCR测定细胞中RELM-β的m RNA相对表达量;用Ed U免疫荧光法测定细胞增殖情况;用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞中Ca浓度。结果:动物实验:H21+WT组大鼠m PAP、RVHI、WT%指标及肺组织中RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2表达均高于H0+WT、H21+RELM-β(P0.05);H0+WT组肺组织中RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2表达均高于H0+RELM-β组大鼠(P0.05)。添加信号通路相关蛋白抑制剂后,与对照组比较细胞增殖减弱,相关下游通路蛋白及cyclin D1/E、CKD2/4表达均减少(P0.05)。结论:低氧时刺激RELM-β经Ca/PKC/ERK MAPK通路促进周期蛋白表达,诱导PASMCs增殖,参与了HPSR和HPH的形成。