清香酒醅源植物乳杆菌SL32-2自溶特性及机制分析

作     者：来欢欢 

作者单位：山西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张秀红

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：乳酸菌 自溶 蛋白质组学 自溶酶 

摘      要：乳酸菌广泛应用于各类发酵食品中,对食品保存以及风味的形成起着关键作用。尤其在清香白酒酿造过程中,乳酸菌的代谢产物乳酸及其与乙醇酯化形成的乳酸乙酯都是清香白酒主要的香气成分;而当乳酸菌过量生长时,乳酸和乳酸乙酯含量升高既影响新酒产量,也因改变清香白酒主体香气成分比例影响其质量。本课题选择清香酒醅来源乳酸菌作为研究对象,考察其自溶特性及其自溶酶的酶学性质,并用蛋白质组学分析其自溶机制,为有效控制乳酸菌繁殖提供新的思路。主要研究结果如下:考察植物乳杆菌SL32-2在不同生长阶段、缓冲液、温度、p H、Triton X-100、孵育时间中的自溶度,结合扫描电镜观察自溶过程中菌体细胞的形态变化,以确定SL32-2自溶的最适条件。结果表明,不同生长阶段的植物乳杆菌SL32-2细胞表现出不同的自溶特性,对数前期细胞自溶度最高为46%;五种反应介质中,SL32-2在PBS缓冲液(50mmol/L,p H 6.5)中自溶度最高为40.16%。SL32-2自溶的最适温度和p H分别为37℃和6.5。Triton X-100可以提高自溶度,当Triton X-100浓度为1 g/L时,SL32-2的自溶度为59.5%;孵育时间为45 h时,SL32-2的自溶度达到52.27%。随着处理时间的延长,自溶过程中的菌体细胞由于自溶酶水解细胞壁而严重皱缩并形成空壳。综上所述,SL32-2自溶的最适条件为:处于对数初期细胞、PBS(50 mmol/L,p H 6.5)、37℃、6.5、Triton X-100浓度为1 g/L。为研究SL32-2自溶酶的酶学性质及底物特异性,以该细菌细胞为底物分析其自溶酶的最适温度及最适p H,结合该菌株在有无外加自溶酶时自溶前后还原糖和氨基酸的变化以及对4种底物的敏感性,分析其自溶酶的底物特异性。结果表明,SL32-2自溶酶的最适p H为7.5,最适温度为37℃;添加自溶酶后,SL32-2的自溶度增加了12.04%、还原糖和氨基酸分别增加了1.05倍和42.83倍;底物特异性分析时,SL32-2自溶酶中β-N-乙酰葡萄糖胺酶、酰胺酶、羧肽酶、内肽酶的活性分别为0.0036 U、0.0027 U、1.1267 U、2.0987 U,表明作用于肽链的酶活性远高于作用于糖链的酶。为探究植物乳杆菌SL32-2的自溶机制及自溶酶的作用机制,采用蛋白质组学方法对自溶前后和自溶酶处理的植物乳杆菌SL32-2细胞进行分析。结果表明,植物乳杆菌SL32-2自溶后,有87个差异表达蛋白,其中上调蛋白20个,下调蛋白67个;自溶相关蛋白如溶菌酶/胞壁质酶和细胞外蛋白仅在对数生长期细胞中表达;肽聚糖结合蛋白、细胞壁水解酶、溶菌酶、γ-D-谷氨酰-内消旋二氨基庚二酸肽酶、葡聚糖蔗糖酶自溶后分别下调0.08、0.09、0.16、0.26和0.4倍;自溶后仅鉴定出一种自溶相关蛋白为推测自溶酶,说明对数生长期的细胞均以最大的速率生长与分裂,细菌数量呈对数增加,需要多种高活性肽聚糖水解酶参与。SL32-2经自溶酶处理后,有97个差异表达蛋白,其中上调蛋白57个,下调蛋白40个;部分参与细胞壁代谢的差异表达蛋白在自溶酶处理后再次表达,如细胞外蛋白、γ-D-谷氨酰-内消旋二氨基庚二酸肽酶和溶菌酶/胞壁质酶;D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、γ-D-谷氨酰-内消旋二氨基庚二酸肽酶和葡聚糖蔗糖酶分别上调169.78、33.82和2.49倍,说明SL32-2经自溶酶处理后,多种细胞壁水解酶显著上调,与对数前期细菌较为相似,通过多种自溶酶协同作用提高对菌体细胞的裂解效果。