TLR2/TLR4-TIPE2在休克肠淋巴液活化CD4+T细胞中的作用

作     者：蒋孙班 

作者单位：河北北方学院 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋丽娜

授予年度：2022年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：失血性休克 休克后肠淋巴液 细胞免疫 免疫功能紊乱 Toll样受体 TLR2/TLR4信号通路 肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2 

摘      要：机体遭受严重损伤、失血可引发失血性休克(hemorrhagic shock,HS)。免疫功能紊乱是重症休克后恶化为脓毒症多器官功能衰竭的关键因素之一。研究发现,休克后肠淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph,PHSML)回流是导致失血性休克后CD4T细胞免疫功能紊乱的重要因素。我们前期研究发现,PHSML对T细胞可能具有双向调节作用,其浓度和刺激时间可造成免疫应答反应由高至低转化,PHSML对T细胞功能的抑制效应可能是休克后脓毒症后期机体免疫失能或发生免疫麻痹的重要调控机制。PHSML对T淋巴细胞的免疫状态具有重要的调节作用,但其确切分子机制尚不清楚。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(Tumor necrosis factorαinduced protein 8 like-2,TIPE2)是维持机体免疫平衡的必需蛋白之一。已有研究表明TIPE2介导免疫细胞表面Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)及其下游分子的表达,改变其免疫应答的类型和强度,但具体的分子机制还有待进一步阐明。此外,研究发现,TLR2/TLR4介导的TIPE2可以在促进炎性因子的分泌以杀伤病原体,或降低免疫应答以改善组织功能障碍等方面发挥重要作用。本研究从体外、体内两个方面研究PHSML致细胞免疫功能紊乱的过程是否与TIPE2密切相关,揭示TIPE2在PHSML调控CD4T细胞免疫功能紊乱的分子机制是否与TLR2/TLR4信号通路有关,旨在探讨TIPE2在失血性PHSML(Post hemorrhagic shock mesenteric lymph,PHSML)调控CD4T淋巴细胞免疫功能中的作用及与TLR2/TLR4分子的相互作用。首先,应用免疫磁珠分选不同小鼠(WT小鼠、TLR2小鼠、TLR4小鼠)脾脏CD4T细胞,流式细胞术检测分选细胞表面CD4的表达,鉴定分选细胞的纯度。将携有TIPE2特异干扰片段(sh RNA)的慢病毒转染CD4T细胞,流式细胞术检测其感染率。结果显示,CD4T细胞纯度为96%以上,慢病毒转染率在80%以上,可以进行后续实验。接着,用不同状态的肠淋巴液(PHSML、正常淋巴液(NML))刺激正常小鼠(WT小鼠)来源的脾脏CD4T淋巴细胞,Western Blotting检测CD4T细胞TIPE2、TLR2、TLR4蛋白水平,RT-PCR方法检测Tipe2、Tlr2和Tlr4的mRNA表达,探讨PHSML对CD4T细胞TIPE2及TLR2/TLR4表达的影响。结果显示,PHSML刺激后,WT CD4T细胞TIPE2、TLR2和TLR4分子的mRNA表达和蛋白表达均上调。然后,为了明确TLR2/TLR4介导的TIPE2在PHSML降低CD4T细胞活化中的作用,应用免疫磁珠分选不同小鼠(WT小鼠、TLR2小鼠、TLR4小鼠)脾脏CD4T细胞,分别给予PHSML、正常淋巴液(NML)刺激,设立空白对照组。应用携TIPE2干扰片段的慢病毒分别转染WT CD4T细胞、TLR4CD4T细胞、TLR2CD4T细胞,培养TIPE2干扰后细胞,沉默TIPE2表达后,分别予以PHSML、NML刺激。CCK8方法检测不同实验组CD4T细胞的增殖功能;流式细胞术检测不同实验组CD4T细胞活化分子的表达;ELISA检测不同实验组CD4T细胞培养上清IFNγ、IL-4、IL-10的浓度水平。结果显示PHSML显著降低了WT CD4T细胞增殖能力、CD25表达、分泌IFNγ的水平,显著提高了WT CD4T细胞分泌IL-4的能力。沉默CD4T细胞TIPE2表达后,CD4T细胞的增殖能力加强、CD25分子的表达上调,IFNγ的分泌水平增高,提示降低TIPE2表达有利于减轻PHSML对CD4T细胞免疫功能的抑制作用。PHSML刺激TLR2CD4T或TLR4CD4T细胞结果显示,TLR2或TLR4缺失减轻了PHSML导致的CD4T细胞功能障碍;PHSML刺激沉默TIPE2表达的TLR2CD4T或TLR4CD4T发现,TIPE2的低表达与TLR2/TLR4缺失的同时存在则消除了这一有利作用。结果提示,PHSML导致失血性休克后细胞免疫功能紊乱的作用与CD4T细胞TIPE2表达有关;以TIPE2为干预靶点,通过调控TLR2/TLR4有利于失血性休克后细胞免疫功能抑制的恢复。最后,为明确TIPE2在PHSML对脾组织细胞调节过程中的地位及意义,进一步阐明PHSML致免疫功能紊乱的分子基础,从整体动物水平探讨TIPE2在PHSML调节脾组织细胞免疫功能中的作用及与TLR2/TLR4信号通路的相互作用机制。实验将不同(WT、TLR2、TLR4)来源雄性小鼠随机分为Sham组、Shock组、Shock+Drai