红棕象甲-Nardonella酪氨酸合成途径中转氨酶催化场所的定位研究

作     者：冯振烽 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：侯有明;黄颖

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：红棕象甲 Nardonella 酪氨酸 转氨酶 转氨反应 

摘      要：红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus(Olivier)属鞘翅目象甲科昆虫,其体内生活着一种内共生菌Candidatus Nardonella。Candidatus Nardonella与象甲科昆虫共生历史超过了1亿年,基因组测序表明其仅仅保留了编码肽聚糖和酪氨酸合成途径,其他代谢途径基因均已缺失。因为酪氨酸这一营养物质是鞘翅目象甲科昆虫黑色素形成和表皮硬化的重要物质,所以酪氨酸在象甲科昆虫生长发育中扮演尤为重要的角色。但内共生菌Nardonella仅能合成到酪氨酸的前体物质4-羟苯基丙酮酸(4-hydrox-phenylpyruvate,4-HPP),无法单独合成酪氨酸,需要依靠宿主编码转氨酶的催化作用才可合成酪氨酸。这种由昆虫-内共生菌双方编码蛋白共同构成一个完整生物合成途径的现象具有普遍性,这种现象与细胞器的进化具有相似性。越来越多研究证明,许多内共生菌提供的生物合成途径还需要宿主编码的蛋白参与,并且发现一些宿主蛋白可以进入到内共生菌细胞中共同参与物质代谢。因此本文探究红棕象甲和胞内共生菌Nardonella酪氨酸合成途径中转氨酶催化场所,提出以下两种科学假设:第一种是内共生菌Nardonella合成的前体物质4-HPP转运到含菌细胞的细胞质中,和宿主编码的转氨酶发生转氨反应,生成酪氨酸;第二种是宿主编码的转氨酶进入到Nardonella细菌细胞中进行转氨反应,生成酪氨酸。主要研究结果如下:(1)三代转录组分析鉴定到五个可以将4-HPP转化为酪氨酸的编码基因,分别是三个谷氨酸草酰乙酸转氨酶基因Rf GOT1、Rf GOT2A、Rf GOT2B和两个酪氨酸氨基转移酶基因Rf TAT1、Rf TAT2。根据三代转录组数据及荧光定量PCR检测分析发现:Rf GOT1及Rf GOT2A在含菌组织内高表达。由此推测这两个基因可能在含菌组织内表达并参与酪氨酸合成途径。(2)干扰Rf GOT1及Rf GOT2A基因48 h后检测含菌组织内酪氨酸水平,发现RNAi处理组的酪氨酸含量明显下降,表明Rf GOT1及Rf GOT2A参与了红棕象甲含菌组织内酪氨酸的合成途径。(3)免疫荧光标记和胶体金免疫电镜标记结果显示,Rf GOT1、Rf GOT2A皆被定位在Nardonella细胞内,证明宿主表达的转氨酶Rf GOT1和转氨酶Rf GOT2A可进入Nardonella细胞内参与酪氨酸的生物合成过程。这些结果表明,红棕象甲编码的谷氨酸草酰乙酸转氨酶Rf GOT1和Rf GOT2A在含菌组织中高表达,并可以进入内共生菌Nardonella细胞内完成转氨催化反应,最终合成酪氨酸。这为宿主昆虫如何调控内共生菌的氨基酸合成提供了新的视角。