辣蓼黄酮对猪伪狂犬病毒感染猪肺泡巨噬细胞诱导炎症反应的干预作用研究

作     者：吴苑滢 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡庭俊

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：辣蓼黄酮乙酸乙酯部位 猪伪狂犬病毒 猪肺泡巨噬细胞 炎症 

摘      要：辣蓼黄酮乙酸乙酯部位(FEA)是中草药辣蓼的活性成分黄酮类物质的提取物之一,具有抗炎、抗病毒、抗氧化和免疫调节等多种生物学作用。猪伪狂犬病毒(PRV)是引起猪伪狂犬病(PR)的病原,该病毒可侵害各个年龄段的猪,主要引起猪的呼吸系统疾病、炎症、生殖障碍,出现呼吸系统疫病综合征,甚至干扰机体的免疫调节系统防御功能。本研究通过研究辣蓼黄酮乙酸乙酯部位对PRV体外感染诱导的免疫细胞(猪肺泡巨噬细胞)炎性因子水平以及基因表达和炎症相关通路的蛋白表达的调节作用,初步探讨辣蓼的开发利用以及辣蓼黄酮乙酸乙酯部位用于病毒感染性疾病的预防与辅助治疗效果,旨在为天然药物在防控动物病毒性疾病的研究提供参考依据。方法:(1)采用PK15细胞扩增PRV,计算病毒TCID50;用不同稀释梯度的PRV(10～10)感染3D4/2细胞2 h后弃上清液,加入新的培养液继续培养4 h、8 h、12 h、24 h、48 h,收集样品测定细胞或上清液分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1、ROS、GSH、NO、iNOS、XOD和MPO水平COX-1、COX-2活性,探讨PRV的病毒浓度、感染时间对3D4/2细胞ROS水平及相关炎性因子含量和酶活性的影响,建立免疫细胞炎症体外模型;(2)筛选出用药物浓度为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的FEA分别作用于10PRV感染的3D4/2细胞,同时设置芦丁对照药物组、LPS阳性对照组,分别在8 h、12 h、24 h、48 h收集样品,测定细胞分泌NO、ROS、GSH、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平和COX-1、COX-2、XOD、MPO、iNOS酶活性,探讨FEA对PRV感染免疫细胞(3D4/2细胞)诱发炎症反应的干预作用;(3)以浓度为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的FEA分别作用于10PRV感染的3D4/2细胞,荧光定量PCR测定细胞在基因转录水平上TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8、iNOS、COX-1、COX-2、C-Jun、C-fos的mRNA表达;Western blot检测细胞内NF-κB、MAPKs通路p65、p38、AKT、ERK1/2、C-Jun等相关蛋白磷酸化的表达水平。结果:(1)测定PRV的TCID为10/0.1 mL;PRV感染3D4/2细胞在不同的时间能够显著或极显著升高IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1、TNF-α、IFN-γ、COX-1、COX-2、XOD、iNOS、MPO、ROS等水平,极显著下调细胞内GSH水平;(2)PRV感染3D4/2细胞在不同的时间点,100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL FEA均能够在一定程度上抑制IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1、TNF-α、IFN-γ、COX-1、COX-2、XOD、iNOS、MPO和ROS等水平的升高和GSH水平的下调,并具有统计学意义;(3)100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL FEA药物组均可抑制病毒感染后细胞TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8、iNOS、COX-1、COX-2、c-jun、c-fos的mRNA表达水平的上升,其中TNF-α、IL-1、IL-6、iNOS、COX-1、COX-2、c-jun、c-fos与PRV对照组比较差异具有统计学意义;(4)与细胞对照组比较,PRV感染3D4/2细胞能显著提高p65、p38、ERK1/2、AKT、c-jun蛋白磷酸化水平,100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL不同剂量的FEA处理PRV感染的细胞后,p65、p38、ERK1/2、AKT、c-jun蛋白的磷酸化水平都出现不同程度的下调,各药物组与PRV组比较差异具有统计学意义。结论:PRV体外感染3D4/2细胞能够明显上调免疫细胞升高活性氧和炎症细胞因子的表达水平,诱发炎症反应;辣蓼黄酮乙酸乙酯部位能有效地干预PRV体外感染诱发3D4/2细胞的炎症反应,下调炎症细胞因子和活性氧的表达水平,降低PRV引起的炎症细胞因子mRNA水平的升高,抑制处于炎症状态的3D4/2细胞的p65、p38、ERK1/2、AKT、c-jun蛋白磷酸化表达的升高。表明PRV感染3D4/2细胞能诱发炎症反应,辣蓼黄酮乙酸乙酯部位对PRV感染诱发的炎症具有调节作用,其调节机制可能与NF-κB、MAPKs等信号通路相关。