线粒体融合蛋白2在大麻二酚对抗神经炎症中的作用

作     者：李梦凡 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐江平

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：多发性硬化 LPS CBD 炎症 EAE Mfn2 

摘      要：目的:神经炎症是中枢神经系统中小胶质细胞及星形胶质细胞激活产生的免疫应答,是神经退行性疾病的重要特征,其中包括多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)。目前,大麻二酚(cannabidiol,CBD)对于神经炎症及免疫反应的调节引起了越来越多的人关注。但是CBD属于多靶点药物,其确切的作用机制尚未明确,所以寻找CBD具体作用机制对多发性硬化症及其他神经炎症性疾病的治疗都会有所帮助。据文献报道,神经元的线粒体融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn2)可参与调控炎症反应。基于CBD、炎症和Mfn2之间的密切关系,本研究旨在考察Mfn2是否参与了 CBD的抗炎保护作用。方法:(1)通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2小胶质细胞建立细胞炎症模型,利用酶联免疫反应(ELISA)、免疫印迹(Western blot)法、MitoSOX试剂盒和四甲基罗丹明乙酯(TMRE)试剂盒检测CBD对抗神经炎症的作用;(2)在LPS刺激的BV2细胞模型中,利用Western blot检测CBD对MAPK通路相关蛋白的磷酸化水平及Mfn2的影响,利用细胞免疫荧光(ICC)检测CBD对Mfn2表达的影响;通过转染si-RNA敲低Mfn2,利用ELISA、MitoSOX、TMRE、Western blot检测敲低Mfn2对CBD抗炎作用的影响;通过转染质粒过表达Mfn2,利用Western blot检测过表达Mfn2能否挽救敲低Mfn2对CBD抗炎作用的破坏;(3)采用脑定位注射法将1 mg/mL LPS(1 μL)注射到C57小鼠的侧脑室中构建体内神经炎症模型,通过体重指标,旷场、高架十字迷宫、新物体识别等行为学指标考察CBD对抗神经炎症的作用;借助Western blot检测小鼠海马组织中Mfn2及小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体(Iba1)蛋白的变化;(4)采用MOG35-55多肽免疫C57雌性小鼠来建立EAE模型,在EAE疾病发展的初期(Day=10),腹腔注射10 mg/kg CBD(每天给药一次,直至实验结束)。利用临床评分指标、苏木素一伊红(H&E)染色、Western blot、免疫荧光(IF)观察CBD对EAE小鼠的保护作用,借助Western blot及IF检测小鼠脊髓部位Mfn2的变化;通过鞘内注射AAV-sh-Mfn2敲低小鼠脊髓部位的Mfn2,再通过临床评分指标、Western blot检测敲低Mfn2后对CBD发挥延缓EAE疾病发展作用的影响。结果:(1)利用LPS刺激BV2小胶质细胞建立细胞炎症模型,给予CBD(1 μM)后可以降低炎症因子IL-6、TNF-α的水平;降低Ibal及炎症相关蛋白iNOS和COX2的表达;减少线粒体超氧化物的生成;提高线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)。(2)在LPS刺激的BV2细胞模型中,CBD(1μM)发挥的作用包括降低p38 MAPK、JNK的磷酸化水平;提高Mfn2蛋白的表达。敲低Mfn2后对CBD作用的影响包括提高了炎症因子IL-6、TNF-α的水平;提高了炎症相关蛋白iNOS和COX2的表达;增加了 JNK的磷酸化水平及线粒体超氧化物的生成;降低了 MMP。过表达Mfn2可以逆转敲低Mfn2上调iNOS、COX2及Iba1表达的作用。(3)在注射LPS的C57小鼠模型中,CBD(10 mg/kg)的作用包括提高模型小鼠的体重;增加在开臂中活动的时间;增加对新/旧事物的探索时间比;上调Mfn2的表达,降低Iba1的表达。(4)CBD(10 mg/kg)对EAE小鼠发挥的作用包括降低临床评分,缓解EAE疾病发展程度;减少脊髓部位的损伤,炎症因子的浸润及上调MBP和Mn2的表达;减少COX2及Iba1的表达。(5)CBD(10 mg/kg)上调EAE小鼠脊髓部位Mfn2的表达;降低CD11b的表达。在EAE模型中,敲低Mfn2对CBD作用的影响包括提高临床评分,加重EAE发展程度;上调脊髓部位COX2及Iba1的表达,降低MBP的表达。结论:CBD能抑制LPS诱导的小胶质细胞激活,进而减轻炎症反应,其作用机制可能是通过激活Mfh2,使JNK失活来改善线粒体功能,抑制小胶质细胞的激活。CBD能改善LPS脑定位注射小鼠的神经功能症状及缓解EAE小鼠的疾病发展,其机制可能与Mfn2介导的线粒体功能改善及炎症因子水平降低有关。