Rufibacter sediminis H-1胞外多糖的制备、结构表征及其生物活性研究

作     者：杨棒棒 

作者单位：河南工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：屈建航

授予年度：2022年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：Rufibacter sediminis H-1 胞外多糖 结构解析 抗氧化活性 条件优化 

摘      要：国内外研究者陆续发现微生物胞外多糖具有如抗氧化等生物活性,与传统抗氧化剂二丁基羟基甲苯(BHT)、硫代二丙酸双月桂酯(DLTP)等相比,微生物胞外多糖具有产量高、生产周期短、易提取等优点。本研究以实验室自主筛选并鉴定的细菌新种Rufibacter sediminis H-1为对象,提取胞外多糖,研究其初级结构和乳化、吸湿、保湿特性,探索对细胞的氧化应激保护作用,并通过优化发酵条件提高多糖产量。主要内容如下:1、采用水提醇沉法提取菌株H-1的胞外多糖(RSP),柱层析进一步纯化,分析RSP的单糖组成、热稳定性、空间结构、表观形态、分子量以及官能团组成。结果表明,细菌H-1所产RSP为酸性多糖,含有多种糖醛酸,蛋白含量0.46%,由两种不同分子量(2662 Da和27945 Da)的多糖构成,单糖组成摩尔比为葡萄糖:甘露糖:半乳糖:葡萄糖醛酸:古洛糖醛酸:半乳糖醛酸:盐酸氨基葡萄糖:N-乙酰基D-氨基葡萄糖为33.5:25.8:13:7.6:6.6:5.9:3.1:2.6,含有α-构型吡喃糖和β-构型吡喃糖单元,表面疏松多孔,具有三螺旋结构和较好的热稳定性。2、使用恒温恒湿干燥器,计算RSP的吸湿保湿率,用疏水性底物检测RSP的乳化性,用不同自由基检测RSP的体外抗氧化性,结果表明,RSP具有较好的保湿、吸湿和乳化特性;对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基、羟基自由基有较好的清除作用,能够还原Fe,均呈剂量依赖性。3、采用MTT法检测RSP对细胞IPEC-1是否具有毒性,并构建IPEC-1细胞氧化应激损伤模型,检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)的活性,RT-PCR检测细胞内Keap1、Nrf2、HO-1 m RNA表达水平的变化。结果表明,RSP对细胞无毒性作用,通过0.4 mmol/L HO处理IPEC-1细胞3 h,细胞中LDH和MDA水平显著升高(P0.05),SOD和CAT的水平显著下降(P0.05),经RSP(400μg/m L)预处理后,氧化应激细胞中LDH含量由539.27U/L降至462.21 U/L,MDA含量由1.54 nmo L/mg降至1.03 nmo L/mg,SOD含量由4.57U/mg增至6.18 U/mg,CAT含量从6.56 U/mg增至9.58 U/mg。RT-PCR结果显示,与对照组相比,HO损伤组中的Nrf2抑制蛋白Keap1 m RNA表达量显著升高(P0.05),Nrf2、HO-1的m RNA表达量显著降低(P0.05);表明RSP提高细胞抗氧化能力可能是通过上调Nrf2信号通路,抑制或减缓HO对IPEC-1细胞造成的氧化损伤。4、利用响应面法优化菌株H-1的多糖产量,结果表明菌株H-1产胞外多糖的最佳条件为海藻糖2.6 g/L、酵母浸粉1.50 g/L、KHPO·3HO 0.30 g/L、Mg SO·7HO 0.05g/L、丙酮酸钠0.30 g/L、p H 7.0、发酵温度27.5℃、接种量8.5%,此条件下发酵54 h时菌株H-1胞外多糖的产量为140.49 mg/L,较优化前提高了4.77倍。本研究为开发菌株Rufibacter sediminis H-1的胞外多糖提供理论参考,有利于拓展对微生物胞外多糖资源与结构的认识。