Trametes sp.48424漆酶的性质、基因克隆及降解氯酚污染物的研究
作者单位：华中师范大学
学位级别：硕士
导师姓名：杨洋
授予年度：2018年
学科分类：07[理学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学]
摘 要：白腐真菌是自然界中可以彻底矿化木质素的一类微生物,这主要依赖于其分泌产生的独特的木质素降解酶系,主要包括木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,LiP)、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)和漆酶(Laccase,Lac)等。漆酶可以催化木质素的碳-碳连键、碳-氧连键断裂,在木质素的降解中发挥重要作用,在环境有机污染物降解等环境生物技术方面也具有巨大的应用价值和潜力。本论文以白腐真菌Trametes sp.48424为材料,分离纯化了 Trametes sp.48424分泌产生的漆酶蛋白LAC-48-2,研究了 LAC-48-2的酶学性质及不同金属离子和有机溶剂对LAC-48-2活性和稳定性的影响;在此基础上探究了 LAC-48-2对不同结构氯酚化合物的降解能力以及降解中对不同金属离子和有机溶剂的耐受性;进一步通过简并引物PCR、热不对称交错PCR(TAIL-PCR)等基因组步移技术克隆获得了 4种不同漆酶全长结构基因及其全长cDNA序列,成功实现了 4种漆酶基因在毕赤酵母中的异源表达。本论文主要研究结果如下:Trametes sp.48424在GYP培养基中培养时,在培养第3天加入终浓度1 mM的硫酸铜诱导产漆酶,在培养第9天漆酶酶活可达最高,铜离子能够明显增加48424菌株的漆酶产量。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和疏水层析等分离纯化过程,成功获得了电泳纯的漆酶蛋白LAC-48-2,纯化后比酶活为599.54 U/mg,分子量为52 kD左右。对纯化LAC-48-2的酶学性质进行了研究,LAC-48-2对ABTS亲和力最强,其次为2,6-DMP和愈创木酚;其最适温度和pH分别是60℃和3.0,随着温度的升高,漆酶稳定性逐渐降低,LAC-48-2漆酶对中性和偏碱性环境具有相对较强的耐受性,而在酸性条件下稳定性相对较弱。研究了不同抑制剂、金属离子和有机溶剂对LAC-48-2漆酶酶活和稳定性的影响:在5种抑制剂中,DTT、NaN3、巯基乙醇对其抑制效果较为明显,LAC-48-2对EDTA-2Na和SDS的耐受性相对较好;在14种金属离子中,LAC-48-2对Mn2+、Mg2+、Na2+、K+等金属离子具有较强的耐受性,高浓度的Cu2+会在一定程度上促进LAC-48-2漆酶活性,在体系中含有100mM硫酸铜时,会将漆酶酶活提升至对照的117.54%。Fe2+对漆酶的抑制效果最强,仅10 mM Fe2+就可使LAC-48-2活性完全丧失;在11种有机溶剂中,LAC-48-2对丙三醇和乙二醇的耐受性较强,LAC-48-2在丙三醇、1,4-丁二醇、丙二醇中稳定性相对较强。利用纯化的漆酶蛋白LAC-48-2开展了对不同结构氯酚化合物(3-氯苯酚、2,6-二氯苯酚、2,3,6-三氯苯酚)以及2-硝基酚的降解研究。LAC-48-2具有较强的降解2,6-二氯苯酚和2,3,6-三氯苯酚的能力,1U/mL的LAC-48-2对800 mg/L 2,6-二氯苯酚的12小时降解率可达99.17%,对200mg/L 2,3,6-三氯苯酚的12小时降解率为96.91%。LAC-48-2对3-氯苯酚降解能力较弱,LAC-48-2不能降解2-硝基酚。LAC-48-2对不同底物的降解能力依次为:2,6-二氯苯酚2,3,6-三氯苯酚3-氯苯酚2-硝基酚。LAC-48-2对混合氯酚(2,6-二氯苯酚+2,3,6-三氯苯酚)中的各种氯酚化合物仍然具有较好的降解作用。当降解体系中同时存在3-氯苯酚、2,6-二氯苯酚和2,3,6-三氯苯酚时,LAC-48-2对3-氯苯酚的降解率依然最低,而对2,6-二氯苯酚和2,3,6-三氯苯酚仍能保持较强的降解能力。研究了不同金属离子和有机溶剂对LAC-48-2降解2,6-二氯苯酚和2,3,6-三氯苯酚的影响:LAC-48-2在降解2,6-二氯苯酚的过程中对Na+、Mg2+、K+、Mn2+、Cu2+等金属离子具有相对较强的耐受性,但是对Fe2+耐受性较差。LAC-48-2在降解2,3,6-三氯苯酚的过程中对Mg2+、Mn2+、K+、Na+、Cu2+等金属离子具有很强的耐受性,80 mM和100 mM的硫酸锰、硫酸钾、硫酸钠、硫酸铜等对2,3,6-三氯苯酚降解影响很小。5%和10%(v/v)的各种有机溶剂对LAC-48-2降解2,6-二氯苯酚几乎没有影响。LAC-48-2在降解2,6-二氯苯酚的过程中对异丙醇和1,2-丙二醇等有机溶剂具有较强的耐受性。5%和10%(v/v)各种有机溶剂对LAC-48-2降解2,3,6-三氯苯酚也几乎没有影响,LAC-48-2在降解2,3,6-三氯苯酚的过程中对丙三醇和乙二醇等有机溶剂耐受性较强。研究还发现介体ABTS能够极大地提高LAC-48-2对2-硝基酚和
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