沉默hsa＿circ＿0046534通过miR-339-5p/MMP2轴抑制食管鳞癌转移和增殖

作     者：徐婷婷 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李沛

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Hsa＿circ＿0046534 食管鳞癌 miR-339-5p MMP2 转移 增殖 

摘      要：背景和目的食管癌是恶性程度较高的消化道恶性肿瘤之一,死亡率位列世界第六位。食管癌的亚型主要包括食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌,其中食管鳞癌是我国最常见的食管癌类型。食管鳞癌早期症状不明显,并且容易发生转移,一经发现便是中晚期,与其他肿瘤相比预后较差。因此我们迫切需要一些早期可检测的生物标志物对ESCC进行无创、精准的诊断和治疗。近几年来,随着基础医学的发展人们发现环状RNA(circ RNA)的异常表达在食管鳞癌的进展和预后中发挥着重要的作用。环状RNA是一种通过反向剪接形成的非编码RNA,以共价键形成闭合环状结构。Circ RNA的主要功能是作为mi RNA的海绵吸附mi RNA进而调控下游靶基因的表达,另外circ RNA还可以调节转录和剪接进而影响基因的表达。已有多篇文献报道circ RNA在肺癌、肝癌、食管癌、结肠癌等肿瘤中发挥着促癌作用,如促进细胞增殖、迁移,抑制细胞凋亡,促进上皮间质转化等,并且与多种肿瘤的诊断及预后有关。本研究探讨了hsa＿circ＿0046534在食管鳞癌中的作用及下游分子机制。我们通过circ RNA高通量测序分析了3对食管鳞癌组织和癌旁组织,在差异表达的circ RNA中发现637个在食管鳞癌组织中上调的circ RNA,并对上调倍数前20的差异circ RNA进行生信分析、文献查询以及预实验分析,筛选出在食管鳞癌中高表达的hsa＿circ＿0046534作进一步研究。后继研究我们发现hsa＿circ＿0046534在食管鳞癌细胞中存在并高表达,下调hsa＿circ＿0046534可以在体外抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭,同时也可以在体内抑制ESCC肿瘤的转移和生长。此外我们发现敲低hsa＿circ＿0046534可以通过解除对mi R-339-5p的吸附作用抑制下游靶基因MMP2的表达。综上所述,本研究表明沉默circ＿0046534可以通过mi R-339-5p/MMP2通路抑制食管鳞癌的转移和生长,circ＿0046534有望作为ESCC新的标志物和靶点为其诊断和治疗提供新的方向。方法1.探究ESCC组织和细胞中hsa＿circ＿0046534的表达情况并对其存在进行鉴定。对3对食管鳞癌组织和癌旁组织进行circ RNA高通量测序,从差异表达的circ RNA中筛选出在食管鳞癌组织中显著上调的hsa＿circ＿0046534,并通过RTq RCR检测该circ RNA在ESCC细胞中的表达水平。设计circ＿0046534的背向引物通过RT-PCR和sanger测序验证其环形结构。2.探索沉默circ＿0046534后对ESCC细胞迁移、侵袭及增殖的影响。通过RT-q PCR技术在ESCC细胞系中筛选高表达circ＿0046534的细胞KYSE30和Eca109,设计小干扰RNA敲低ESCC细胞中circ＿0046534的表达水平并用RT-q PCR验证敲低效果。通过细胞增殖实验、平板克隆实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验观察敲低circ＿0046534对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭水平的影响。3.探究circ＿0046534在ESCC细胞中吸附的靶mi RNA及该mi RNA对ESCC细胞迁移侵袭的影响。使用数据库查找circ＿0046534结合的mi RNA,构建野生型和突变型报告基因载体,通过双荧光素酶报告基因实验和RT-q PCR验证circ＿0046534是否能吸附该mi RNA。采用Transwell迁移和侵袭实验、细胞增殖实验探究上调该mi RNA对ESCC进展的影响。4.Rescue实验探究沉默mi R-339-5p是否可以逆转sh-circ＿0046534对食管鳞癌细胞迁移、侵袭及增殖的抑制作用。构建稳定敲低circ＿0046534的sh-KYSE30和sh-Eca109细胞,采用RT-q PCR检测敲低效果。接着将mi R-339-5p inhibitor转染入sh-KYSE30和sh-Eca109细胞,通过RT-q PCR验证敲低效果。通过Transwell迁移、侵袭实验以及克隆形成、细胞增殖实验探究沉默mi R-339-5p是否可以逆转sh-circ＿0046534对食管鳞癌细胞迁移、侵袭及增殖的抑制作用。5.筛选mi R-339-5p的靶基因以及探究该靶基因对ESCC的影响。通过数据库筛选mi R-339-5p的下游靶基因,并构建野生型和突变型荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告基因实验验证mi R-339-5p是否可以吸附该靶基因。通过Western blot实验验证过表达mi R-339-5p后,细胞中该靶基因的表达。通过RT-q PCR、Western blot实验验证过表达该基因对ESCC细胞上皮间质转化的影响。6.Rescue实验探究过表达MMP2是否能逆转沉默circ＿0046534对ESCC细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。通过Western blot实验验证在sh-KYSE30和sh-Eca109中MMP2的表达水平。接着进行Rescue实验观察与沉默circ＿0046534的细胞相比,过表达MMP2对ESCC细胞迁移和侵袭能力的影响。7.探究敲低circ＿0046534在裸鼠体内对ESCC肿瘤的转移及生长的影响。构建稳定敲低circ＿0046534且表达荧光素酶的Eca109细胞(sh-Eca109-Luc)和对照组细胞(sh NC-Eca109-Luc)。构建裸鼠尾静脉转移模型和裸鼠食管鳞癌细胞异种移植瘤模型,通过HE染色、免疫组织化学实验和RT-q PCR实验检测敲低circ＿0046534对ESCC转移和生长的影响。结果1.Circ＿0046534在ESCC组织和细胞中存在并且高表达。2.敲低circ＿0046534可以抑制ESCC细胞的迁移、侵袭和增殖能力。3.Circ＿0046534通过海绵吸附mi R-339-5p,上调mi R-339-5p可以抑制ESCC细胞的迁移、侵袭和增殖能力。4.Rescue实验证明沉默mi R-339-5p可以部分逆转敲低circ＿0046534对ESCC细胞迁移、侵袭及增殖的抑制作用。5.mi R-339-5p吸附并负向调控MMP2,上调MMP2可以促进ESCC细胞的上皮间质转化。6.Rescue实验证明过表达MMP2可以部分逆转沉默circ＿0046534对ESCC细胞迁移和侵袭的抑制作用。7.在裸鼠尾静脉转移模型中,与对照组相比敲低circ＿0046534组小鼠表现出对ESCC肺转移的抑制。在裸鼠食管鳞癌细胞异种移植瘤模型中,下调circ＿0046534在体内抑制了ESCC的生长,circ＿0046534敲低组肿瘤的体积和重量明显小于对照组。且与对照组相比circ＿0046534敲低组瘤体circ＿0046534表达水平降低且mi R-339-5p表达水平升高。结论1.沉默circ＿0046534通过miR-339-5p/MMP2信号通路抑制食管鳞癌迁移、侵袭和增殖。2.沉默circ＿0046534在体内可抑制ESCC肿瘤的转移及生长。