塞来昔布抑制牙龈卟啉单胞菌和4NQO诱导的鼠食管鳞癌发生发展

作     者：许海军 

作者单位：河南科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高社干;李智涛

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：牙龈卟啉单胞菌 4-硝基喹啉-1-氧化物 鼠食管鳞癌模型 炎症微环境 塞来昔布 COX-2 

摘      要：目的:应用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)联合4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide,4NQO)诱导C57BL/6鼠食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发生发展,明确P.gingivalis诱发食管炎症微环境在鼠ESCC发生、发展过程的作用,探讨塞来昔布(Celecoxib,CB)通过降低食管组织炎症反应预防ESCC发生发展的分子机制,为ESCC预防及治疗提供理论基础。方法:1各组鼠处理:C57BL/6雄鼠随机分为对照(CON)组、P.gingivalis组、4NQO组、4NQO+P.gingivalis组、4NQO+P.gingivalis+CB组等5组,各组30只。动物实验中心适应2周后,含复合抗生素(甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素和万古霉素;Antibiotic cocktail,ABC)饮水处理2周,鼠饮水中甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素浓度分别为0.2g·L、万古霉素0.1g·L。除对照组和P.gingivalis组外,其余3组给予含30μg·m L 4NQO饮水喂饲8周。结扎鼠上颌第二磨牙后,相应组别鼠接受每周3次口腔感染P.gingivalis、CB等处理持续至实验终止。2鼠食管及前胃组织处理:实验第34周,所有鼠颈椎脱臼处死,收集鼠食管和前胃,沿纵轴剖开鼠食管及前胃组织,固定并拍照;采集鼠食管黏膜拭子样本,每笼6只小鼠中随机取3只鼠食管10%甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋、5μm切片、HE染色。另3只鼠食管加入适量RNAfixer后于-80℃冰箱保存,后续提取蛋白或RNA样品。3 m RNA转录组:CON组、P.gingivalis组、4NQO组、4NQO+P.gingivalis组、4NQO+P.gingivalis+CB组等各组中分别随机取4个鼠食管样本,5组共20个鼠食管样本进行m RNA转录组测序,分析各组之间的差异表达基因并进行生物学功能和通路富集分析。4实时荧光定量PCR:Trizol法提取鼠食管组织总RNA,OD260/280比值确定RNA纯度并计算RNA浓度,1μg RNA进行c DNA反转录。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)检测鼠食管组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、Cyclin D1和c-MYC表达,以GAPDH为内参基因,各基因表达定量分析采用2法。5免疫组化:鼠食管组织切片脱蜡,梯度酒精水化,Tris-EDTA抗原热修复,一抗4℃过夜孵育,本实验所用一抗浓度分别为Ki67(1:600,CST)、COX-2(1:600,CST)、p H2AX(1:500,CST)和p-STAT3(1:100,CST)。免疫组化(Immunocytochemistry,IHC)应用SP-9000试剂盒,结果评定采用阳性细胞百分比和染色强度综合评分。6蛋白免疫印迹:各组鼠食管组织磁珠研磨,加入蛋白裂解液(配方为:RIPA:EDTA:蛋白酶抑制剂=100:1:1),提取组织蛋白,BCA方法进行蛋白定量,聚丙烯酰氨凝胶电泳,检测各组蛋白中p-STAT3表达量。7统计学分析:采用Graph Pad Prism 8.0.2统计学软件进行数据处理分析,Image J图像处理软件计算鼠食管肿瘤面积。比较各组间分子表达差异采用t检验或单因素方差分析,检验水准为α=0.05。结果:1鼠体重变化:各组鼠26周前,体重逐渐增加,26周后,4NQO组、4NQO+P.gingivalis组和4NQO+P.gingivalis+CB组鼠体重逐渐下降,4NQO+P.gingivalis组体重下降最明显,CB给药延缓了鼠体重的持续下降。2鼠食管黏膜大体表现:34周时,将离体鼠食管组织沿纵轴切开、固定后,肉眼观察食管黏膜,4NQO+P.gingivalis组鼠食管黏膜病变最严重,其次为4NQO组鼠食管病变。除对照组和P.gingivalis组外,其余各处理组鼠食管黏膜表面粗糙并有多个乳头状增生病灶,乳头状增生病灶呈不规则状、灶性分布,4NQO+P.gingivalis组和4NQO组鼠食管黏膜中乳头状增生的平均病灶分别为2.55±1.20个、1.00±0.98个,Image J图像软件测得的黏膜病变面积分别为5.04±1.94 mm、0.90±0.67 mm,4NQO+P.gingivalis+CB组鼠食管黏膜的乳头状病灶数和病变面积分别减小至1.18±0.60个和2.13±1.14 mm。3鼠食管黏膜镜下表现:与对照组相比(食管壁平均厚度37.98±1.97μm),其余组鼠食管壁不均一增厚,P.gingivalis感染组鼠食管稍微增厚,平均厚度50.86±3.15μm,4NQO+P.gingivalis联合促增殖效果最显著,4NQO作用次之,该两组鼠食管壁平均厚度分别为243.34±13.64μm和91.80±3.61μm,CB处理明显阻断了4NQO+P.gingivalis联合促增殖作用,使食管壁厚度与4NQO组相近(平均厚度分别为88.86±19.63μm和90.76±14.36μm)。CB组食管黏膜轻、中度不典型增生(Mild and moderate Dysplasia,MMDYS)、重度不典型增生(Severe Dysplasia,SD)和原位癌(Carcinoma in situ,CIS)的病灶数明显低于4NQO+P.gingivalis组和4NQO组,反映食管黏膜上皮细胞数目的过度增生(Hyperproliferation,HYP)病变在CB组和4NQO组中均与4NQO+P.gingivalis组相近,浸润癌(Invasive carcinoma,IC)仅见于4NQO+P.gingivalis组。4食管黏膜炎症变化:4NQO+P.gingivalis组鼠食管组织中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表达显著高于其它各组。4NQO组鼠食管组织中,IL-1β和TNF-α表达水平高于其它4组,但差异不显著。在CON组、P.gingivalis组和CB组,鼠食管组织中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ等分子表达无明显差异。5免疫组化和蛋白免疫印迹:4NQO+P.gingivalis组鼠食管黏膜的增生、非典型增生和癌病灶中,p-STAT3显著富集于这些病变的细胞核内。4NQO组鼠食管病变组织中细胞核内仅有弱阳性的p-STAT3表达,CB组鼠食管组织中p-STAT3表达更低。6肿瘤相关分子表达:4NQO+P.gingivalis组鼠食管组织中c-MYC和Cyclin D1表达最高,但仅Cyclin D1高表达具有显著性差异。免疫组化检测各组鼠食管组织中COX-2、Ki67和p H2AX表达,发现4NQO+P.gingivalis组鼠食管组织中COX-2、Ki67和p H2AX分子表达最高,CB组鼠食管组织中各分子表达降低。7分析各组鼠m RNA转录组数据,与CON组、P.gingivalis组和4NQO组比较,4NQO+P.gingivalis组差异表达基因为425个,主要富集于细胞因子、炎症、补体系统等,CB处理逆转了其中597个基因的表达模式。结论:P.gingivalis通过诱发炎症微环境促进ESCC发生发展,塞来昔布降低食管组织炎症反应能够预防ESCC发生发展。