非CODIS STR基因座复合扩增体系的构建及法医学应用研究

作     者：谭睿 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高玉振;李成涛;张素华

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 0838[工学-公安技术] 100105[医学-法医学] 10[医学] 

主      题：法医物证学 STR 非CODIS系统 复合扩增 毛细管电泳 

摘      要：[目的]1.筛选非CODIS系统补充STR基因座,构建多重荧光复合扩增体系。2.对所构建体系进行法医学应用系统效能验证并调查其遗传学参数,评估该体系在法医学研究和司法鉴定实践中的应用价值。[方法]1.基因座的筛选:通过检索相关数据库和文献,筛选在中国汉族人群中具有良好多态性的非CODIS STR基因座。使用Primer Premier5.0软件和NCBI数据库中的Primer-BLAST工具进行引物设计,将设计好的引物进行单点扩增和琼脂糖凝胶电泳,以验证单个STR基因座引物的扩增效能。***荧光复合扩增体系的构建:将筛选出的基因座根据扩增片段大小分为四组,在每组各个基因座的前引物5 端分别用荧光染料(FAM、HEX、TAMRA和ROX)进行标记。并调整各基因座的引物浓度、Taq酶浓度、退火温度、扩增循环次数、终延伸时间等反应条件对复合扩增体系进行优化。应用ABI3500XL遗传分析仪检测扩增产物,对各基因座进行Sanger测序后按照国际法医遗传学会(International society of forensic genetics,ISFG)的命名规则对其进行命名,制备等位基因分型标准品,最后根据GeneMapper ID-X(美国Thermo Fisher公司)软件的使用要求编写和导入Panel和Bin文件并分析检测结果。***荧光复合扩增体系的性能验证:依照ISFG和DNA分析方法科学工作组(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,SWGDAM)的验证指南,对构建的STR复合扩增体系的灵敏度、种属特异性、精确性、均衡性等指标进行法医学评估,并利用该体系调查中国汉族人群216例健康无关个体的遗传学数据,以评估该系统在法医学个体识别和亲权鉴定中的应用价值。[结果]1.本研究筛选出符合法医学应用的23个非CODIS STR基因座、1个CODIS系统核心基因座及1个性别鉴定基因座,成功构建出包含25个STR基因座的荧光复合扩增检测体系。该体系所有基因座均获得了完整且清晰的基因分型结果,无干扰分型的非特异性扩增产物,能够实现准确分型。2.本研究对该体系进行的法医学验证结果显示,在DNA模板量低至0.125ng时,25个基因座仍可获得完整分型;所检测的狗、鸡、驴、猫、牛、蛇、兔、小鼠、鸭、羊和猪等11种非人源基因组DNA中,均未出现干扰分型结果的特异性产物峰;在不同浓度的PCR抑制剂影响下仍能获得较好的分型结果;在男女混合样本比例大于1:3时主、次要成分均能获得完整分型;该体系的等位基因偏移不超过0.50bp,在3500XL遗传分析仪可识别范围内。3.本研究对该体系进行的群体遗传学调查结果显示,24个常染色体STR基因座在216份无关个体样本中共观察到241个等位基因,等位基因频率范围为0.0045～0.4773;经Bonferroni校正后,该24个常染色体STR基因座均符合Hardy-weinberg平衡(p0.05/24);杂合度范围为0.6455～0.9545;多态信息含量范围为0.6230～0.9010,个体识别概率范围为0.8299～0.9752,累计个体识别概率大于1-1.24×1-10-27,累计非父排除概率大于1-5.72× 1-10-12。[结论]本研究成功构建了包含24个常染色体STR基因座和1个性别鉴定基因座Amologenin在内的STR荧光复合扩增体系,其中23个为非CODIS STR基因座,并包含4个miniSTR基因座。该体系分型结果准确可靠,灵敏度达0.125ng,具有人类种属特异性,抗抑制能力强。该体系为法医学研究提供了新的遗传标记和检测手段,对常规CODIS STR试剂盒不能解决的疑难亲权鉴定案件能够补充更多的遗传信息,提高系统效能,为DNA司法鉴定领域提供了新的技术储备。