马铃薯锌指蛋白StZFP基因的克隆和功能分析

作     者：朱文峰 

作者单位：青海大学 

学位级别：硕士

导师姓名：贺苗苗

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：马铃薯 锌指蛋白 逆境胁迫 生物信息学分析 

摘      要：锌指蛋白(Zinc finger protein)转录因子是真核生物中的关键转录因子,具有典型的“手指状结构与锌离子结合形成稳定结构,在植物生长过程中至关重要。本实验使用生物信息学分析方法和在线软件对马铃薯中C2H2型锌指蛋白(ZFP)家族成员进行筛选鉴定,实时荧光定量分析晚疫菌诱导下StZFP基因的表达模式。基于生物信息分析和基因表达情况,在马铃薯青薯9号中克隆了StZFP16、StZFP593并进行初步的功能探究。主要研究结果如下:1.本文共筛选了16个C2H2型马铃薯锌指蛋白基因(StZFP),进化分析将其聚为四个亚族,不均匀分布在8条染色体上,蛋白家族高度保守基序为motif 1。启动子区预测分析得到一些与光照、激素、生长发育、低温、干旱胁迫响应等相关的顺式作用元件。2.在致病疫霉菌诱导下C2H2型StZFP基因家族分为四种表达模式,即基因成员分别在12 h、24 h、24 h和60 h、72 h显著上调表达。其中PGSC0003DMT400018457、PGSC0003DMT400084805、PGSC0003DMT400056957基因的表达量分别约为0 h的47、20、7倍。在24 h显著上调表达是StZFP基因成员的一般表达模式,包括13个基因。结果表明,马铃薯C2H2型StZFP基因成员的表达均响应晚疫病菌的诱导并且可能参与了马铃薯与晚疫病菌早期互作的过程。3.本实验在马铃薯青薯9号中克隆了StZFP16和StZFP593,其CDS长度、氨基酸、C2H2型锌指蛋白保守结构域分别为1107 bp、369 aa、9个;363 bp,121 aa,1个。通过组织特异性表达分析,结果表明,StZFP593、StZFP16分别在块茎、花瓣中显著上调表达,均在茎中表达水平最低,推测这两个基因可能与马铃薯器官发育有关。此外,对这两个基因进行晚疫病菌诱导、低温、钠盐胁迫条件下的胁迫响应表达分析,结果发现,基因StZFP16、StZFP593均响应了三种胁迫,在不同胁迫条件下的不同时间点显著上调表达。基因StZFP593对晚疫病菌诱导的响应比StZFP16更为强烈、而StZFP16对低温、钠盐胁迫的敏感性更强。4.为了进一步探索StZFP16、StZFP593的基因功能,实验利用同源重组、Gateway方法分别构建StZFP16和StZFP593基因的表达载体,采用冻融法将StZFP16、StZFP593表达载体转入农杆菌,以根癌农杆菌遗传转化法转化烟草。StZFP593基因得到了7株阳性转化苗,转基因植株将用于后期的功能验证。