马来酸替加色罗靶向MEK1和MEK2抑制胃癌生长的机制研究

作     者：王梓童 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘康栋;江亚南

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃癌 化学预防 马来酸替加色罗 MEK1 MEK2 

摘      要：背景和目的胃癌(Gastric cancer,GC)是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,在全球范围内,胃癌发病率排名第五,死亡率排名第四。胃癌的特点是发病隐匿,早期无症状或症状较轻微,导致大多数患者诊断延误,生存期较差。根治性手术是唯一可能治愈胃癌的治疗方式,但是约60%的患者手术切除后发生复发,导致患者的5年生存率仍然很差。因此,迫切需要低毒高效的新型化学预防药物以提高患者的治愈率并降低复发率。开发新的抗癌药物是一个昂贵和耗时的过程,需要大量的细胞和动物研究支持,并开展严格的临床研究以证实临床前的结果。越来越多的研究表明,在已有的药物中发现药物的新用途是一种有效的策略。本研究中,我们筛选了食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的药物库,前期研究发现马来酸替加色罗(Tegaserod maleate)明显抑制食管鳞癌细胞的增殖,我们课题组近期研究发现其在胃癌细胞中展现出更高的抑制活性。在此基础上,我们利用细胞增殖实验和克隆形成实验,检测马来酸替加色罗对胃癌细胞HGC27和AGS的增殖能力和克隆形成能力的影响。通过计算机分子对接模型以及下拉实验寻找马来酸替加色罗作用的靶点,并利用体外激酶实验证实马来酸替加色罗对靶点的调节作用。为了评估马来酸替加色罗在体内的抗肿瘤活性,我们构建胃癌患者来源的组织异种移植模型(Patient-derived xenograft,PDX)。本研究为马来酸替加色罗作为胃癌化学预防药物提供了理论支持。方法1.评价马来酸替加色罗在体外对胃癌细胞增殖的研究方法 利用细胞毒性实验检测马来酸替加色罗对胃癌细胞HGC27和AGS的毒性作用;利用细胞增殖实验评估马来酸替加色罗对胃癌细胞HGC27和AGS增殖能力的影响;利用软琼脂克隆形成实验和平板克隆形成实验检测马来酸替加色罗对胃癌细胞HGC27和AGS非锚定依赖性生长以及锚定依赖性生长的影响。2.研究马来酸替加色罗与MEK1和MEK2的结合的方法利用计算机分子对接模型预测马来酸替加色罗与MEK1和MEK2激酶的结合情况;利用pull down实验验证马来酸替加色罗分别与外源性和内源性MEK1和MEK2激酶的结合。利用细胞热位移测定实验检测马来酸替加色罗与MEK1和MEK2结合后对蛋白稳定性的影响。3.评价马来酸替加色罗对MEK1和MEK2激酶活性及下游分子的影响利用体外激酶实验检测马来酸替加色罗对MEK1和MEK2激酶活性的影响;利用Western blotting实验检测马来酸替加色罗对MEK1和MEK2下游分子表达情况的影响;利用免疫共沉淀实验检测马来酸替加色罗作用后,细胞内MEK1和MEK2激酶对p-ERK1/2 T202/Y204激活情况的影响;利用免疫荧光实验评估马来酸替加色罗对p-ERK1/2 T202/Y204荧光表达水平的影响。4.评价MEK1和MEK2对胃癌细胞增殖能力的影响的研究方法利用CRISPR/Cas9技术构建MEK1和MEK2敲除的胃癌稳转细胞株,利用细胞增殖实验和平板克隆形成实验评估MEK1和MEK2激酶对胃癌细胞增殖和克隆形成能力的影响;同时,检测MEK1和MEK2敲除后,马来酸替加色罗对胃癌细胞的影响。5.评价马来酸替加色罗在体内对胃癌的生长抑制效果的研究方法通过构建胃癌患者来源的组织异种移植模型(Patient-derived xenograft,PDX),检测马来酸替加色罗在体内抑制胃癌生长的情况;利用免疫组织化学染色评估马来酸替加色罗对Ki-67表达情况的影响;利用Western blotting实验检测马来酸替加色罗对肿瘤组织中p-ERK1/2 T202/Y204蛋白水平的影响;选取已用于临床的MEK1/2抑制剂曲美替尼,通过比较马来酸替加色罗和曲美替尼对肿瘤的抑制效果及对Ki-67表达水平的影响,评估马来酸替加色罗用于临床的潜力。结果1.马来酸替加色罗在体外抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成用50μM马来酸替加色罗处理时,马来酸替加色罗对胃癌细胞HGC27和AGS有明显的毒性作用;不同浓度的马来酸替加色罗(0、0.25、0.5、1和2μM)处理胃癌细胞HGC27和AGS,显著抑制胃癌细胞的增殖能力和克隆形成能力。2.马来酸替加色罗与MEK1和MEK2结合并抑制其激酶活性计算机分子对接模拟结果显示,马来酸替加色罗与MEK1激酶的Asp208,Met146和Asp152位点结合,与MEK2激酶的Gly81和Gly83位点结合;Pull down实验结果显示,马来酸替加色罗可分别与与重组MEK1和MEK2蛋白,在293F中过表达的MEK1和MEK2蛋白以及胃癌细胞裂解液中的MEK1和MEK2蛋白结合;细胞热位移测定实验显示,马来酸替加色罗与MEK1和MEK2蛋白结合后蛋白的稳定性更高。体外激酶实验结果显示,不同浓度的马来酸替加色罗抑制MEK1和MEK2的激酶活性并且成浓度依赖性,同时可直接抑制p-ERK1/2T202/Y204的活化。3.马来酸替加色罗抑制胃癌细胞中MEK1/2-ERK1/2信号通路不同浓度的马来酸替加色罗(0、0.25、0.5、1和2μM)处理后,胃癌细胞中MEK1/2下游分子p-ERK1/2 T202/Y204,p-RSK2 S227的表达水平显著降低,并呈浓度依赖性;马来酸替加色罗抑制胃癌细胞内MEK1和MEK2对ERK的激活作用;细胞免疫荧光实验结果表明,不同浓度的马来酸替加色罗(0、0.25、0.5、1和2μM)处理细胞后,p-ERK1/2 T202/Y204的荧光表达随药物浓度的增加逐渐降低。4.马来酸替加色罗通过MEK1和MEK2抑制胃癌细胞的增殖在胃癌细胞HGC27和AGS中分别敲除MEK1和MEK2后,细胞的增殖能力和克隆形成能力受到抑制;用马来酸替加色罗处理MEK1和MEK2敲除的胃癌细胞,对照组的胃癌细胞活力低于敲除组,提示敲除MEK1和MEK2后的细胞对马来酸替加色罗的敏感性降低,说明马来酸替加色罗通过MEK1和MEK2激酶发挥抑制作用。5.马来酸替加色罗在体内抑制胃癌PDX模型移植瘤的生长。与对照组相比,马来酸替加色罗处理组在体内显著抑制胃癌PDX模型肿瘤体积和肿瘤重量;马来酸替加色罗抑制肿瘤组织中Ki-67以及p-ERK1/2T202/Y204的表达。6.与MEK1/2抑制剂曲美替尼相比,马来酸替加色罗显著抑制胃癌生长。马来酸替加色罗与已用于临床的MEK1/2抑制剂曲美替尼均对胃癌PDX模型表现出显著的抑制作用,但两处理组之间瘤体积没有显著差异,瘤组织中Ki-67表达水平的抑制也并无统计学意义上的差异,提示马来酸替加色罗有作为MEK1/2抑制剂应用于胃癌化学预防的潜力。结论马来酸替加色罗与MEK1和MEK2结合并抑制其激酶活性,通过抑制MEK1/2-ERK1/2信号通路来抑制胃癌细胞在体内外的增殖。