H1N1、H3N2、B型流感病毒适配体的筛选与表征

作     者：曾静怡 

作者单位：华侨大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李招发;何定峰

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：流感病毒 DNA适配体 SELEX 纳米金 环状适配体 

摘      要：研究背景流感病毒是一种严重的呼吸道感染病毒,多次引起世界性大流行,每年流感季传染极强,造成损失严重。因此加强对流感病毒的监控和检测,对于减少经济损失和提高人类卫生健康标准,都具有非常深远的现实意义。现有的流感病毒检测方式大多需要大型实验仪器以及专业技术人员支持,检测成本较高。近代发展起来的DNA适配体具有很多抗体所没有的优势,已广泛应用于各种靶标的快速检测。因此筛选能够高效特异性结合流感病毒的适配体是十分有必要和意义的。研究目的本课题拟筛选特异性结合H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、B型流感病毒的适配体,并建立多种表征方式对其进行表征。研究方法选取H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、B型流感五种流感病毒作为靶标,建立与完善磁珠-SELEX筛选流程,优化适配体筛选条件及PCR扩增条件,并对每轮筛选进行监控,确保筛选的顺利进行。对富集文库序列进行的测序,并对其进行同源性分析和结构分析。采用点杂交、凝胶阻滞、SYBR Green I法、酶联适配体测定法（ELAA）对备选适配体进行亲和力和特异性表征。建立适配体-纳米金法对H1N1口腔咽拭子样本进行检测。最后,对筛选得到的适配体进行成环实验,通过酶联适配体测定法对其亲和力进行表征。研究结果经过12轮筛选,文库富集状况较好。完成7条H1N1、9条H3N2、12条H5N1、23条H7N9、18条B型备选适配体测序。采用点杂交、凝胶阻滞这两种定性表征方式在备选适配体中筛选得到2条H1N1适配体A2、A6,1条H3N2适配体B3和1条B型流感适配体E11。利用SYBR Green I法、酶联适配体测定法对四条适配体进行表征,验证其为亲和力和特异性都较好的适配体,测得四条适配体的解离常数（Kd值）分别是（48.64±12.47）nmol/L、（29.06±5.230）nmol/L、（39.79±5.469）nmol/L、（34.52±10.20）nmol/L。使用适配体-纳米金法对H1N1两条适配体A2、A6进行亲和力与特异性表征,并使用适配体-纳米金法将口腔咽拭子样本直接进行鉴定,检测效果良好。H1N1的两条适配体改造成环,利用酶联适配体测定法对成环后的适配体进行亲和力表征,测得两条适配体的Kd值为（31.91±7.757）nmol/L,（3.116±0.8743）nmol/L,即成环后的适配体依旧具有较好的亲和性。结论本项研究建立与完善适配体筛选方式以及多种表征方式,筛选得到多条流感病毒适配体,为H1N1、H3N2、B型流感病毒的检测提供一种新型专用探针。同时对适配体成环进行初步探究,这对于适配体在检验方面的运用具有非常广阔的应用前景。