缢蛏“申浙1号”耐高温家系筛选与评价及GPx基因表达分析

作     者：申奔龙 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈和定

授予年度：2021年

学科分类：090801[农学-水产养殖] 0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：缢蛏 家系 高温 抗氧化 谷胱甘肽过氧化物酶 

摘      要：缢蛏(Sinonovacula constricta)广泛分布于我国沿海滩涂,在浙、闽、鲁、苏、辽、粤、桂等省沿海均有养殖,养殖历史悠久,是我国四大养殖贝类之一。本科研团队经过连续5代连续选育后,得到了具有生长优势明显、抗逆性强、成活率高、遗传稳定的优质高产的缢蛏“申浙1号新品种。为适应全球气候变暖、滩涂环境恶化、保证缢蛏产业持续发展,在快长基础上,继续筛选了抗逆缢蛏新品系。本论文在“申浙1号群体的基础上进行家系建立及早期耐高温筛选;相关抗氧化酶、抗氧化物及抗氧化通路的测定分析;抗氧化基因谷胱甘肽过氧化物酶GPx(Glutathione Peroxidase)的基因克隆、序列分析及表达,具体研究结果如下:1、继续筛选缢蛏“申浙1号耐高温新品系,该实验先期建立了16个全同胞家系,并在第2、8、22、36日对各家系的生长进行了监测,有3个家系(家系1、2、9)在浮游期存活率较低被挑除,保留生长较好的13个家系继续培养。在稚贝期分别挑选了3组壳长较长(家系14、15、16)和3组壳长较短(家系3、4、5),共6个家系进行了半致死温度试验。结果表明:稚贝期结束时,家系3、4、5的壳长显著低于其他家系。家系8、14、15、16的壳长和壳高显著大于其他家系(P0.05)。家系6、14在稚贝期的成活率显著高于其他家系,其中家系14的成活率最高,达到83.17±0.85%。在半致死温度试验中,家系16的半致死温度最高达到了36.64℃,且壳长较长的家系与壳长较短的家系半致死温度差异显著(P0.05),确定了家系14、15、16为耐高温家系。在综合评估了各家系的壳长、存活率和耐热性等数据后最终确定家系14是适合生产的最优家系,家系15、16可用作备选家系。2、各家系过氧化物酶POD(Peroxidase,POD)、总抗氧化能力T-AOC(Total antioxidant capacity,T-AOC)的趋势随温度升高而升高,在34℃达到最高并出现拐点;GSH(Glutathione,GSH)的含量随温度升高而增加;同时壳长较长家系的三种抗氧化能力在高温下均显著高于壳长较短家系(P0.05)。各家系肿瘤蛋白p53(tumor protein 53,p53)表达水平在34℃前随温度增高而增高,但之后表达量下降,37℃表达量反而低于常温状态下的表达量;壳长较长家系的SESN1(Sestrin 1)平均表达量显著高于壳长较短家系(P0.05)。通过家系选育和高温实验挑选具有抗逆性的耐高温后代,并通过抗氧化能力的测定在生理生化角度证明了家系挑选的必要性。3、克隆谷胱甘肽过氧化物酶GPx基因,结果显示缢蛏GPx基因的c DNA全长总共1338 bp。系统进化树软件分析结果缢蛏GPx基因与菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)GPx基因的亲缘关联最为接近,系统进化分析的结果也与传统形态学分类相符合。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)结果可看出在外套膜中的相对表达量最高,其次是肝胰腺和鳃,在斧足和性腺组织的相对表达量较低(P0.05)。荧光定量结果显示GPx基因在急性温度刺激下,外套膜、鳃和肝胰腺的表达量会发生不同的变化,表明GPx在高温时对缢蛏各组织中都起到了重要作用。总结:以缢蛏“申浙1号新品种为研究对象,在该群体中建立了若干家系,以抗氧化能力(抗氧化酶活性、还原性物质含量、抗氧化通路关键基因的表达量)作为参考,筛选了抗高温缢蛏新品系。该研究克隆了缢蛏的GPx基因全长序列,并进行了其时空表达分析和高温应激表达分析,证实GPx在缢蛏高温应激中可能扮演了重要角色。在当前全球变暖的背景下,该研究筛选了抗高温缢蛏新品系,在生产中有助于提高缢蛏养殖的成功率和养殖效益。