藏药盘花垂头菊多糖提取工艺优化及其对巨噬细胞功能的影响

作     者：刘相海 

作者单位：西南民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘群

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 1005[医学-中医学] 100513[医学-民族医学(含：藏医学、蒙医学等)] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：藏药盘花垂头菊 多糖 巨噬细胞 吞噬功能 分泌功能 细胞焦亡 

摘      要：盘花垂头菊（Cremanthodium discoideum Maxim）是菊科多年生高寒草甸植被,生长于喜马拉雅山、海拔3600～5300m的特有物种（集中分布于青藏高原和西南山区）。目前针对盘花垂头菊的研究主要集中在活性成分倍半萜类和黄酮类物质的抗菌、抗炎和抗肿瘤等方面,对其它活性成分的研究报道较少。本研究以藏药盘花垂头菊为研究对象,采用水提醇沉法,以影响多糖提取的主要因素提取时间、提取温度及料液比为自变量,水提液多糖得率为响应值,在单因素试验的基础上,运用中心组合设计（Box-Behnken Design）三因素三水平的响应面分析,优化盘花垂头菊多糖水提工艺;以盘花垂头菊多糖为研究材料,小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为研究对象,采用CCK-8、EA/YC、中性红、Griess、ELISA等方法,探讨盘花垂头菊多糖对巨噬细胞毒性/增殖功能、Fc/C3b受体功能、吞噬功能、分泌功能（NO、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、LZ）的影响;以盘花垂头菊多糖为研究材料,小鼠腹腔巨噬细胞J774A.1为研究对象,采用Hoechst/PI染色结合ELISA法,研究盘花垂头菊多糖对LPS+ATP诱导体系巨噬细胞焦亡（Caspase-1、Caspase-3、IL-18、IL-1β、LDH）的影响。取得的研究结果如下:（1）单因素试验结合响应面分析,藏药盘花垂头菊多糖的最佳水提工艺为提取时间2.5h、料液比1:20、提取温度75℃,实际平均提取率为4.99%,与理论值5.17%基本相符;（2）CCK-8细胞毒性/增殖试验表明,盘花垂头菊多糖在巨噬细胞RAW264.7的最大无毒浓度为1000μg/m L,其中31.25～1000μg/m L均可促进巨噬细胞RAW264.7增殖（500μg/m L,增殖率最高）;31.25～500μg/m L质量浓度盘花垂头菊多糖对巨噬细胞Fc/C3b受体活性具有增强作用（500μg/m L,EA、YC花环率最高,分别为63.38%、74.25%）;31.25～500μg/m L质量浓度盘花垂头菊多糖具有增强巨噬细胞吞噬功能并表现出剂量依赖性特点;（3）Griess/ELISA法试验表明,31.25～1000μg/m L质量浓度盘花垂头菊多糖具有促进巨噬细胞分泌NO、IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ和LZ的作用并表现出剂量依赖性特点;（4）Hoechst/PI/ELISA法试验表明,62.5～500μg/m L质量浓度盘花垂头菊多糖具有不同程度的抑制由LPS+ATP诱导的巨噬细胞焦亡的作用（抑制细胞分泌Caspase-1、IL-18、IL-1β和LDH）,125～500μg/m L质量浓度盘花垂头菊多糖通过增强c AMP-PKA通路中AC和PKA的酶活性抑制炎症小体NLRP3的活化达到抑制巨噬细胞焦亡的产生。综上,藏药盘花垂头菊多糖通过增强巨噬细胞Fc/C3b受体活性以增强巨噬细胞的免疫粘附能力和吞噬能力,促进巨噬细胞分泌以参与机体的免疫调节,抑制巨噬细胞焦亡的产生以增强机体的抗炎能力,研究结果为藏药盘花垂头菊的临床应用和深度开发提供了数据支撑。