EZH2在支气管上皮细胞炎症反应中的作用及机制研究

作     者：杨贤苗 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：钱粉红

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：支气管哮喘 支气管上皮细胞 EZH2 miR-139-5p Notch1 

摘      要：研究背景和目的支气管哮喘是一种由遗传因素和环境因素共同作用的异质性疾病。气道上皮在受到过敏原、空气污染物以及病原微生物等刺激时,上皮的屏障功能的破坏是气道炎症的重要机制。zeste增强子人类同源物2(EZH2)可发挥抑制基因表达的作用,参与炎症、自身免疫、恶性肿瘤的进展,但在哮喘的发病机制中的研究甚少。本研究旨在脂多糖(LPS)构建的BEAS-2B细胞炎症反应模型中探究EZH2在LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症反应中发挥的生物学作用及可能的机制。研究方法1.LPS诱导BEAS-2B细胞的炎症模型构建1.1用0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的LPS刺激BEAS-2B细胞12 h后,CCK-8法检测细胞活力变化。1.2 BEAS-2B细胞经LPS(10μg/ml)刺激12 h,q RT-PCR检测IL-6、IL-8、TNF-α、mi R-139-5p、Notch1 m RNA表达。Western blot检测Notch1、EZH2、H3K27me3蛋白表达。2.干扰EZH2对BEAS-2B细胞炎症的影响在BEAS-2B细胞中转染si-EZH2及其阴性对照24 h后用LPS刺激12 h,通过q RT-PCR和Western blot法检测各处理组细胞炎症因子IL-6、IL-8、TNF-αm RNA及蛋白表达水平。3.干扰EZH2抑制BEAS-2B细胞炎症反应的分子机制在BEAS-2B细胞中转染si-NC、si-EZH2、mimic-NC、inhibitor-NC、mi R-139-5p mimic、mi R-139-5p inhibitor、si-EZH2+mi R-139-5p inhibitor 24 h后用LPS刺激12 h,采用q RT-PCR法检测mi R-139-5p、Notch1的m RNA表达水平,随后通过Western blot法检测Notch1蛋白表达水平。研究结果1.LPS可以诱导构建细胞炎症模型1.1 LPS(0.1μg/ml及其以上浓度)能抑制细胞活力,且浓度越高,抑制作用越强。选择10μg/ml LPS进行后续实验。1.2 LPS处理组细胞中的IL-6、IL-8、TNF-α、Notch1 m RNA相对表达量以及EZH2、H3K27me3、Notch1蛋白表达水平较对照组上调,mi R-139-5p m RNA表达较对照组下调。2.干扰EZH2可减轻BEAS-2B细胞的炎症反应转染si-EZH2组的细胞中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平下调,同时H3K27me3蛋白表达水平也下调。3.EZH2可通过调控EZH2-mi R-139-5p-Notch1轴参与BEAS-2B细胞炎症反应。3.1转染si-EZH2或mi R-139-5p mimic后,IL-6、IL-8、TNF-α的表达下调。转染mi R-139-5p inhibitor后,IL-6、IL-8、TNF-α的表达上调。转染si-EZH2+mi R-139-5p inhibitor后,能够部分挽救si-EZH2组下调的IL-6、IL-8、TNF-α的表达。3.2转染mi R-139-5p mimic后,Notch1 m RNA和蛋白表达水平降低,相反转染mi R-139-5p inhibitor后,Notch1表达水平升高。与对照组相比,转染si-EZH2能够降低细胞中Notch1表达水平,转染si-EZH2+mi R-139-5p inhibitor后能够部分挽救si-EZH2对Notch1表达的抑制作用。研究结论在LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症模型中,干扰EZH2通过上调mi R-139-5p从而抑制其靶基因Notch1表达减轻LPS诱导的细胞炎症反应。