核仁素调控钙通道Orai1活化促进乳腺癌细胞增殖机制研究

作     者：谷春明 

作者单位：湖北医药学院 

学位级别：硕士

导师姓名：武福云

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：钙库调控的钙内流 钙通道 核仁素 增殖 乳腺癌 

摘      要：背景:乳腺癌在女性恶性肿瘤中排名第一,其发病机制极其复杂,其中钙信号异常与肿瘤的发生发展密切相关。细胞内钙离子是介导各种细胞功能的重要的第二信使,钙稳态失衡是许多疾病发生的基础。因此,细胞钙离子浓度受钙离子通道、钙离子交换器以及钙泵等严格控制。Orai1蛋白是细胞内非常重要的一个钙通道。Orai1介导的钙内流是非兴奋细胞钙离子进入胞内的最主要的方式,称为钙库调控的钙内流（SOCE）。已有报道指出在乳腺癌中Orai1常常是过度表达和活化,然而其分子机制尚不清楚。我们前期研究证明了核仁素Nucleolin（NCL）是Orai1新的相互作用蛋白,且与乳腺癌密切相关。目的:研究Orai1和NCL之间的相互作用机制,以及它们在乳腺癌发展中发挥的作用,从而为NCL与Orai1这两个抗肿瘤靶点的临床应用提供更多的理论基础。方法:Pull-down及质谱鉴定Orai1与NCL相互作用、Western-blot和Co-IP检测NCL与Orai1的结合;Pull-down和免疫荧光实验检测NCL与Orai1的具体作用区域;免疫组化检测NCL在癌旁组织与乳腺癌之间的表达差异;Western-blot分析PCNA、AKT、P-AKT、PKC和P-PKC蛋白的表达;MTT、集落形成、EDU及划痕实验检测乳腺癌细胞的增殖情况;钙成像和共聚焦荧光测钙实验检测细胞中钙离子的变化;裸鼠荷瘤实验检测Orai1多肽和钙通道抑制剂2-APB对乳腺癌细胞增殖的影响;使用方差分析和t检验（SPSS 20.0）进行统计分析,P0.05判断是否具有统计学意义。结果:质谱鉴定发现NCL是Orai1新的相互作用蛋白,Western-blot证明NCL能够与Orai1的N端结合。Pull-down和免疫荧光实验证明NCL的N端和C端可以与Orai1相互作用。免疫组化实验结果表明NCL在乳腺癌组织表达水平更高。Western-blot实验显示NCL过表达促进PCNA的表达,且P-AKT和P-PKC表达水平升高。MTT实验、克隆形成实验、EDU实验以及划痕实验显示NCL过表达可以促进乳腺癌细胞的增殖。钙成像实验和共聚焦荧光测钙实验检测结果显示NCL可以激活Orai1促进钙离子内流。裸鼠荷瘤实验证明利用合成的Orai1多肽阻断NCL-Orai1相互作用以及利用钙通道抑制剂2-APB阻断Orai1活化导致裸鼠皮下瘤瘤体和重量减少。结论:NCL通过与Orai1相互作用激活钙库调控的钙内流,从而促进乳腺癌细胞的增殖,抑制Orai1活化及阻断NCL-Orai1相互作用能够抑制乳腺癌细胞增殖。