千层金MbCFAT1基因克隆研究及育种应用展望

作     者：尹冠文 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李永裕;杨超

授予年度：2022年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：松柏醇酰基转移酶 基因克隆 甲基丁香酚 育种应用 

摘      要：千层金（Melaleuca bracteata）,系桃金娘科白千层属常绿乔木,叶片为金黄或黄绿色,树形优美,抗逆性强,是目前流行的乔木树种之一。千层金叶片具有较高精油提取率,其精油具有抗菌消炎等特性,主要成分为甲基丁香酚。松柏醇酰基转移酶（Coniferyl alcohol acyltransferase,CFAT）作为甲基丁香酚合成途径中的关键酶,可催化松柏醇生成乙酸松柏酯,然后经丁香酚合成酶（Eugenol synthase,EGS）和丁香酚O-甲基转移酶（Eugenol O-methyltransferase,EOMT）催化进行还原、甲基化等一系列反应形成甲基丁香酚。目前关于千层金中松柏醇酰基转移酶对甲基丁香酚合成途径的功能尚未见报道。本文在分析野生型草莓甲基丁香酚含量的基础上,以千层金幼苗为试验材料,从实验室前期建立的千层金精油合成途径中差异表达的转录组数据库中筛选出一条CFAT基因,并将其克隆出来,通过生物信息学分析、相关性分析、亚细胞定位、原核表达以及真核表达分析,对MbCFAT1的功能进行初步研究,为日后利用其进行草莓抗病育种奠定了基础,并为后续深入研究千层金天然产物分子代谢机制与千层金精油品质改良提供理论依据。结果如下:1.利用RT-PCR技术从千层金叶片中克隆得到一个CFAT基因,命名为MbCFAT1,该基因全长为1428bp,编码475个氨基酸,分子量为51.30KDa,等电位点为8.72,为不稳定亲水性蛋白;通过氨基酸序列比对和系统进化树分析结果表明,MbCFAT1编码氨基酸序列与矮牵牛Ph CFAT相似度最高;其氨基酸序列存在保守结构域HXXXD和DFGWG,属于BAHD酰基转移酶家族,与草莓Fa AAT2的亲缘关系最近。2.采用外源Me JA喷施处理,利用q RT-PCR技术研究,结果表明千层金叶片在不同浓度Me JA处理后MbCFAT1基因表达量均有升高,其中0.01mmol·L-1的Me JA处理后MbCFAT1基因表达量增加最为显著;千层金叶片精油采用GC-MS分析发现,不同浓度Me JA处理下千层金叶片的甲基丁香酚含量上升,MbCFAT1基因表达量和甲基丁香酚含量变化的相关性分析表明,不同浓度Me JA处理下的MbCFAT1基因表达量与甲基丁香酚含量变化呈正相关关系。初步推测千层金MbCFAT1可催化松柏醇生成乙酸松柏酯,是甲基丁香酚合成途径中的关键基因。3.利用pNC-Cam1304-sub N载体构建携带GFP的融合蛋白pNC-Cam1304-MbCFAT1-GFP,转化农杆菌介导烟草瞬时表达,通过激光扫描共聚焦显微镜观察其亚细胞定位结果,显示MbCFAT1定位于细胞核与细胞质膜中。4.利用pET-32a（+）载体进行MbCFAT1原核表达载体构建,获得重组蛋白pET-MbCFAT1,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出蛋白分子量约为69KDa的目的蛋白;通过SDS-PAGE检测样品发现MbCFAT1蛋白主要以包涵体形式表达。5.使用NC克隆载体pNC-Cam1304-35s构建过表达载体pNC-Cam1304-MbCFAT1-35s,通过农杆菌介导转化黄果森林草莓。利用q RT-PCR技术检测MbCFAT1基因相对表达量,GC-MS检测草莓果实中甲基丁香酚含量,结果表明,转基因草莓果实中MbCFAT1表达量比对照组提高了39.03倍,甲基丁香酚含量比对照组提高了138%。