同时检测三种食源性致病菌的机器视觉显微成像微球计数传感方法研究

作     者：冯牛 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈翊平

授予年度：2022年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 080203[工学-机械设计及理论] 0802[工学-机械工程] 100403[医学-营养与食品卫生学] 10[医学] 

主      题：食源性致病菌 磁性纳米颗粒 核酸杂交 计算机视觉 同时检测 

摘      要：食源性疾病不仅严重危害人民的身体健康,同时会导致严重的经济损失。据统计,约45%的食源性疾病由食源性致病菌致病引起。并且,同一食品基质中通常存在两种以上的食源性致病菌。因此,同时对食源性致病菌进行精准检测,是有效防控食源性疾病的重要途径之一。目前基于培养法、酶联免疫吸附测定法、聚合酶链式反应等技术的传统分析方法较难满足食源性致病菌快速检测需要的灵敏度及检测效率。本课题拟将不同粒径的聚苯乙烯微球作为多元信号探针,构建一款微球显微成像平台对其进行识别及成像,辅之以计算机视觉自动计数软件,组合成显微成像微球计数系统(Microscopic imaging and computer vision-enabled digital counting biosensor,MCDC)用于3种食源性致病菌的同时准确快速检测。本研究结合超顺磁性纳米颗粒、DNA杂交等技术,使用150 nm磁性纳米颗粒作为磁分离载体,2μm、4μm和6μm三种不同直径的聚苯乙烯微球分别作为金黄色葡萄球菌(***)、单增李斯特菌(***)、沙门氏菌(Salmonella)的信号探针,基于显微成像微球计数系统,对DNA杂交反应形成的复合物进行分类统计,以实现上述三种食源性致病菌的同时、灵敏、高效定量分析。具体内容如下。1.显微成像微球计数系统的构建本章基于血球计数法原理,使用聚苯乙烯微球作为信号探针,明场光学显微镜作为观测设备,构建了一款可灵敏检测聚苯乙烯微球浓度改变的显微成像平台,该平台可达到10个微球每微升的灵敏度。同时,基于计算机视觉技术,编写了可“替代肉眼计数的计算机视觉微球识别软件,单张图像识别速度小于1 s,有效提升了计数效率。通过有效结合二者,构建了显微成像微球计数系统。此外,通过组合不同直径的聚苯乙烯微球,为实现多种目标物的分析检测奠定了基础;由于本系统的信号采集由明场光学显微镜与便携式电脑完成,对环境条件要求较低、性能稳定,且易于微型化;信号处理由计算机视觉微球计数软件完成,该过程高通量、迅速。因此,该系统具有多元分析、快速、灵敏、成本低廉等优点,具有可以应用于食品安全检测、体外诊断、环境监测等领域的良好潜力与条件。2.基于显微成像微球计数系统检测单增李斯特菌基于显微成像微球计数系统,本章通过利用显微成像微球计数系统的光学极限性质,即无法观察、分辨直径为150 nm的磁性纳米颗粒,将150 nm的磁性纳米颗粒作为磁分离固相载体,利用直径为4μm的聚苯乙烯微球作为信号探针,分别在其表面共价偶联寡核苷酸探针,进行DNA杂交反应,通过显微成像微球计数系统统计DNA杂交反应所形成复合物的数量,从而间接实现对于***的定量分析检测。研究结果显示,基于MCDC检测***的检出限低至23 CFU/mL,线性范围可达到10-10 CFU/mL,且该方法具有良好的特异性、加标回收率在88.1%至117.9%之间,变异系数小于20%。在针对鸡蛋样本进行实际应用时,该方法与实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)具有较好的一致性。3.基于显微成像微球计数系统同时检测三种食源性致病菌基于MCDC对不同粒径聚苯乙烯微球的精准区分及灵敏检测,本章将2μm、4μm和6μm三种不同直径的聚苯乙烯微球分别作为检测***,***和Salmonella的信号探针,结合DNA杂交反应与磁分离技术,使用MCDC分类、统计2μm、4μm和6μm聚苯乙烯微球的数目,分别对应***,***和Salmonella的含量。结果表明,***,***和Salmonella的检出限分别为30 CFU/mL、31 CFU/mL和49CFU/mL,线性范围均可达到10-10 CFU/mL,且检测过程可控制在1小时以内,在实际样本检测过程中同样表现出与qPCR良好的一致性。本方法不需要核酸的预扩增,避免了核酸交叉污染导致的假阳性及假阴性,为同时、灵敏、快速检测食源性致病菌提供了新思路。